大鼠针刺置高台固定方法

王宇,宁友,2,王培育,3,杨永清

(1.上海中医药大学上海市针灸经络研究所分子生物学(针灸)实验室,上海 200030;2.复旦大学附属华山医院中西医结合研究所,上海 200040;3.河南中医学院,郑州 450008)

大鼠是在针刺机理实验中被经常使用的动物。常用的大鼠固定方法有捆绑固定、器械固定、手部抓取固定等[1]。目前国内外普遍采用的针刺大鼠固定方法为束缚固定法,包括狭小空间固定与捆绑固定。但是束缚固定会引起大鼠束缚应激效应,与针刺效应叠加,严重干扰了针刺效应的客观分析。因此,如何在针刺时,选择适宜的大鼠固定方法,尽量减少应激效应对针刺效应的干扰,是针灸研究中所面临的关键问题之一。

为此,我们利用大鼠具有畏高的特性,设计了大鼠置高台的固定方法。以大鼠1型糖尿病模型为实验对象,观察束缚固定与置高台固定下针刺对糖尿病大鼠血糖的影响。结果表明,与束缚固定方法相比,置高台固定法对大鼠糖尿病模型血糖影响效小,是一种适合的大鼠针刺固定方法。

1 材料与方法

1.1 动物分组

健康雄性SD大鼠,CL级,购自中国科学院上海实验动物中心,体重(220±10)g,36只,根据计算机随机数字分为6组,每组6只。正常组(Normal)采取普食,不做任何处理;1型糖尿病模型组(DM)采取普食,1型糖尿病模型制作;1型糖尿病模型-束缚固定组(DM-Binded)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束缚固定30 min;1型糖尿病模型-束缚固定-针刺组(DM-Bin-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天束缚固定30 min,同时针刺干预;1型糖尿病模型-置高台固定组(DM-Elevated)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高台固定30 min;1型糖尿病模型-置高台固定-针刺组(DM-Ele-Acu)采取普食,1型糖尿病模型制作,每天置高台固定30 min,同时针刺干预。

1.2 仪器设备、材料与试剂

0.30 mm×15 mm针灸针(苏州医疗用品厂有限公司出品的华佗牌无菌针灸针);罗氏 ACCU-CHEK Advantage血糖仪(罗氏诊断产品上海有限公司)。

链脲佐霉素(Streptozotocin,STZ,A.R.,Sigma)、柠檬酸(Citric acid monohydrate,A.R.,上海化学试剂有限公司)、柠檬酸三钠(Trisodium citrate dehydrate,A.R.,上海化学试剂有限公司)、罗氏ACCU-CHEK AdvantageⅡ血糖试纸(罗氏诊断产品上海有限公司)。

1.3 大鼠1型糖尿病模型造模方法

大鼠1型糖尿病模型造模方法[2,3],SD大鼠被置于模拟昼夜变化(12 h白天,12 h黑夜)的清洁室内,温度 20℃～23℃,湿度为 50%,所有动物造模前一天禁食过夜8 h。将STZ溶解在0.1 mol/L,柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液中(pH 4.2),配制成 1%STZ溶液,其中柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液是由0.1 mol/L柠檬酸三钠母液和0.1 mol/L柠檬酸母液按1:1.32体积配制。按照 60 mg/kg剂量,一次性腹腔注射 STZ溶液,诱导糖尿病大鼠模型。

1.4 大鼠置高台固定方法

将大鼠放置于木制高台踏板(6 cm×12 cm)上,距地面50 cm(见图1、2),每天1次,每次30 min。

图1 大鼠针刺置高台固定照片

图2 木制高台设计侧面图(左)与俯视图(右)

1.5 大鼠束缚固定方法

大鼠腹部向下,四肢用医用胶布粘缚于木板上,胸部用 1 cm宽皮带固定,防止逃脱。每日 1次,每次30 min。

1.6 针刺方法

取肝俞、脾俞、肾俞[4]。肝俞位于第 9胸椎下旁开5 mm之两旁肋间;脾俞位于第12胸椎下旁开5 mm之两旁肋间;肾俞位于第2腰椎下旁开5 mm之两旁肋间[5]。针刺方法采用直刺 6 mm,行平补平泻,每 5 min行针1次(以200次/min捻转速度,左右捻针20次为行针1次),留针20 min。隔日针刺1次,共4次。

1.7 大鼠血糖检测方法

采用尾静脉采血法,用锋利刀片在尾静脉上切开小口,取少量血液,用罗氏ACCU-CHEK Advantage血糖仪测定血糖浓度并记录。测定时间安排在STZ注射前第8、1天和STZ注射后第1、2、3、5、7、9、11、13、15天,共11次,测定的时间安排在下午进行,两侧尾静脉可交替切割,切割后用棉球压迫止血。

1.8 统计学方法

本实验采用血糖浓度参数评价1型糖尿病模型。多组比较用单因素方差(One-Way ANOVA)分析,组间析因分析用LSD检验,检验水准=0.05。两组比较用独立样本t检验,检验水准=0.05。

束缚固定与置高台固定下,针刺对DM大鼠血糖的平均影响率分析方法为非针刺组血糖均值(GLU1)与针刺组血糖均值(GLU2)的差值(GLUΔ)除以DM组血糖均值(GLU0),即为针刺对血糖的平均影响率(I),计算公式为 I=(GLU1-GLU2)/GLU0×100%。

2 结果

图3-A可见,正常大鼠血糖值稳定。糖尿病模型组大鼠自造模第1天起,血糖水平逐渐增高,与正常大鼠比较,自造模第1天至第15天内,具有显著统计学差异(P=0.000)。糖尿病模型-束缚组血糖与糖尿病模型组比较,存在明显统计学差异(P＜0.05)。表明束缚固定可明显降低糖尿病模型的血糖水平。糖尿病模型-置高台组血糖与糖尿病模型组比较无统计学差异(P＞0.05)。表明置高台虽然可以引起糖尿病模型大鼠血糖水平的变化,但无统计学意义。

图3-B可见,与模型组比较,置高台针刺可明显降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。与糖尿病模型-置高台组比较,置高台针刺同样可明显降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)。表明去除置高台的本底效应,针刺依然对糖尿病大鼠血糖具有明显下调作用,针刺的效应得到明显体现。

图3-C可见,束缚固定可明显降低糖尿病模型的血糖水平(P＜0.05)。糖尿病模型-束缚-针刺组血糖与糖尿病模型组比较,也存在明显统计学差异(P＜0.05),但与糖尿病模型-束缚组比较无明显统计学差异(P＞0.05)。表明束缚应激效应显著,在此效应基础止,针刺本身的效应难以体现。

图3-D可见,与糖尿病模型组相比,虽然束缚-针刺与置高台-针刺均可明显下调血糖水平(P＜0.05),但糖尿病模型-束缚-针刺组与糖尿病模型-置高台-针刺组相比,两组血糖水平差异不明显(P＞0.05)。

图3 束缚固定与置高台固定下针刺对糖尿病大鼠血糖的影响

在束缚固定与置高台固定下,针刺对糖尿病大鼠血糖的平均影响率分析,如图 4所示,糖尿病模型-束缚-针刺组对糖尿病模型的血糖平均影响率为 12%(1%～15%),在造模第1天最大,第2天最小;而糖尿病模型-置高台-针刺组对糖尿病模型的血糖平均影响率为 52%(39%～74%),在造模第 1～3天较大。两者对大鼠血糖的平均影响率差异显著(P＜0.05)。进一步显示在不同固定条件下,针刺对糖尿病模型大鼠血糖的影响效果不同,置高台情况下,针刺对糖尿病模型大鼠血糖的影响效应得到明显体现。

3 讨论

图4 束缚固定与置高台固定下,针刺对糖尿病大鼠血糖平均影响率的比较

应激是指机体内在的动态平衡状态被打破后所出现的全身性非特异性适应反应过程。应激反应以机体受到内外环境刺激后产生下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴及交感肾上腺髓质活性增强为特征[6]。应激会干扰机体已有的平衡,引起机体的反馈与负反馈效应,产生损伤或保护作用,影响生理与病理反应。针刺效应是机体的自我调控的结果,因此在应激背景下进行针灸效应研究,必然导致应激效应与针刺效应的叠加,将会干扰对针灸效应的研究。目前在针刺机理实验中普遍采用的大鼠针刺固定方法为束缚固定法。但是束缚固定会引起大鼠束缚应激效应。我们利用大鼠具有畏高的特性,设计了大鼠针刺置高台的固定方法,以尽量减少应激效应对针刺效应的干扰。

本文结果显示,糖尿病模型-束缚固定、糖尿病模型-束缚-针刺均能明显降低糖尿病模型的血糖水平,两者之间无明显统计学差异,表明束缚应激效应显著,在此效应基础止,针刺本身的效应难以体现。糖尿病模型-置高台组血糖与糖尿病模型组比较无统计学差异。与糖尿病模型组和糖尿病模型-置高台组相比较,糖尿病模型-置高台-针刺均可明显降低糖尿病模型大鼠血糖水平,表明去除置高台的本底效应,针刺依然对糖尿病大鼠血糖具有明显下调作用,针刺的效应得到明显体现。尽管糖尿病模型-束缚-针刺组与糖尿病模型-置高台-针刺组相比,两组血糖水平差异不明显,但在束缚固定与置高台固定下,针刺对糖尿病大鼠血糖的影响率分析结果显示,糖尿病模型-束缚-针刺组对糖尿病模型的血糖平均影响率为 12%,而糖尿病模型-置高台-针刺组对糖尿病模型的血糖平均影响率为 52%,二者存在明显统计学差异,进一步显示置高台情况下,针刺对糖尿病模型大鼠血糖的影响效应得到明显体现。

有文献报道将大鼠置于高台可诱发急、慢性应激,引起血浆中皮质酮水平和海马中乙酰胆碱升高[7]。本文数据显示,置高台虽然能引起糖尿病大鼠模型血糖水平的变化,但无统计学意义,说明置高台固定对血糖的影响很有限。可能提示,大鼠针刺置高台固定方法,更适用于非应激性疾病的研究。

因大鼠置高台时自然体位处于趴卧位,因此该固定方法较适合于选取大鼠头背部、四肢外侧的穴位进行针刺。如需针刺大鼠腹侧面以及四肢内侧面的穴位,尚需在此基础上探索更理想的大鼠固定方法。

参考文献

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