人工回灌条件下地下环境要素对氯苯生物降解行为的影响研究

何海洋，张文静，谷小溪

(吉林大学 a.地下水资源与环境教育部重点实验室;b.环境与资源学院;c.水资源与环境研究所，长春 130021)

1 研究背景

地下水人工回灌作为一项水资源管理策略被世界各国高度重视，其目的主要是为了防止和控制地面沉降、增加地下水资源量、防止海水入侵等［1］。特别是近年来地表水受工农业发展的影响，有机污染较突出，与地下水水质差异性较大，人工回灌过程对地下水的有机污染不容忽视［2］。

本次研究区为控制区域地面沉降，计划开展相应的地下水人工回灌，而目前在拟采用的回灌水源中监测到氯苯等有机组分，因而将氯苯确定为典型有机组分。氯苯是化工生产的重要原料，广泛存在于基本有机合成、染料、塑料、香料、农药等生产的废水中［3］，氯苯是有机化合物(VOCS)的一种，在人体内有蓄积作用，会抑制神经中枢，麻醉肌肉，有较大的毒性，被美国EPA列为优先污染物［4］。

国内外学者开展一系列关于氯苯的生物降解实验研究，从厌氧和好氧条件2个方面开展了氯苯降解菌的筛选、降解特性以及降解能力等方面研究［5］。结果表明:好氧条件下微生物对氯苯的降解速度较快而且能够彻底的降解氯苯，并释放出氯离子。厌氧条件下微生物对氯苯的降解速度较慢且容易产生一些致死产物，影响氯苯生物降解作用的进行，而Pardue等［6］认为厌氧条件下有利于微生物对氯苯类有机物进行还原脱氯作用，从而进行氯苯的降解。于海斌(2011年)等研究［7］表明氯苯的降解模型主要有Monod模型和Heukelekian模型。李明堂(2008年)等［8］发现菌株通过邻位裂环途径降解氯苯，实现氯苯的彻底降解。当氯苯和葡萄糖共存于同一体系时，微生物对氯苯的降解能力下降。许炉生(2011年)等研究［9］表明，生物膜电极法降解氯苯是新型人为降解的途径。甘平(2001年)等研究［10］表明，驯化的微生物能以氯苯做为唯一碳源和能源实现其彻底降解，还发现氯苯类有机物中氯取代数越多，越难被微生物降解。

虽然国内外学者关于氯苯的生物降解实验开展很多，但是基于人工回灌条件下氯苯的生物降解研究还十分缺乏，特别是回灌过程中地下环境要素对氯苯生物降解行为的影响研究还有待于进一步开展。因此，本文在总结前人研究的基础上，结合研究区人工回灌试验场地的实际条件，开展了人工回灌背景条件下氯苯的生物降解行为研究，以期为人工回灌的全面实施提供技术保障。

2 试验场地水文地质概况

本次试验场地占地面积约为75000m2，浅部潜水含水层发育较差，主要有第一、二、三、四承压含水层均匀分布。人工回灌的目标含水层是第四承压含水层，顶板标高在－164.00m，底板标高在－216.50m左右，平均厚度52.55m，产状近似水平。岩性以灰色细砂、灰色含砾中细砂为主，颗粒组成具有明显的不均匀性。第四承压含水层地下水径流缓慢形成Cl·HCO3－Na型水，矿化度为0.873～0.898g/L，pH 值在7.45～7.61之间，属于中性水。总硬度为254.34～268.70mg/L，属于软水。

3 材料与方法

3.1 主要实验仪器及实验材料

实验仪器:G＆GT2200型电子天平，常熟双杰测试仪器厂;HZQ2F160恒温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司;101A2型电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司;UV－5800(PC)紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司;7890A安捷伦气相色谱仪，美国安捷伦公司。

实验试剂:氯苯(分析纯)，上海泰正化工有限公司。氯苯的储备液制备方法是加入一定量的氯苯至蒸馏水中(466.3 mg/L，20℃)，实验初始浓度通过逐级稀释来确定。实验取样的氯苯溶液用0.45μm有机系滤膜过滤后用安捷伦7890A气相色谱仪测试，检测方法为吹扫捕集/气相色谱法。气相色谱条件:①色谱柱:HP－50毛细管色谱柱，恒定流量1.5mL/min，滞留时间1.6min;②柱箱:40℃ (恒定 3 min)，以10℃/min升温至100℃，维持10min;③检测器:火焰离子化检测仪(FID)，温度 300℃，H2流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹25mL/min;④前进样口:温度220℃，隔垫吹扫3 mL/min;⑤进样量:1μL，以保留时间定性，峰面积定量。

实验材料:实验用介质取自研究区第四承压含水层，在实验使用前保存在4℃冰箱中，含水介质的物理性质及颗分结果见表1，表2。

表1 介质的物理性质Table 1 Physical properties of soil samples

3.2 实验方法

为探讨回灌过程中地下环境要素对氯苯生物降解行为的影响，本次根据“夏灌冬用”“冬灌夏用”等回灌特点，设定本次实验温度为0，10，20℃，恒温振荡培养箱的常用温度区间为5～30℃，特殊的0℃温度的设置是将控温按钮调至最低0.1℃，并默认此温度为0℃。并且，随着回灌过程所带来的地下水环境中溶解氧的变化，实验设置为好氧和厌氧条件，好氧条件利用的是空气中的氧气，厌氧条件是将震荡器充满氮气。

3.2.1 含水层介质对氯苯的生物降解实验

称取10 g第四承压含水层的中细砂8份，分别装入200mL的玻璃瓶中，向每份样品中加浓度为稀释1 000倍的氯苯储备液100mL，避光，放置在恒温振荡器(振荡速度120 r/min)上。分别在震荡的1，2，3，5，7，9，12，15 d 取 20mL 氯苯水溶液，测定氯苯的浓度和微生物浓度，所有操作均在无菌条件下进行。

3.2.2 不同浓度条件下的生物降解实验

根据拟定回灌水源水质的监测数据中氯苯浓度值的不同，选取的稀释浓度范围将其涵盖，得到不同的浓度梯度，分别取不同稀释倍数:100倍、500倍、750倍、1 000倍、3 000倍、5 000倍、10 000倍的氯苯水溶液100mL，装入200mL的玻璃瓶中，分别与10 g第四承压含水层中细砂混合，充分振荡反应后(振荡时间为实验3.2.1确定的各温度以及好氧与厌氧下的平衡时间)取20mL氯苯水溶液测定其浓度和微生物的浓度，所有操作均在无菌条件下进行。

3.2.3 微生物浓度的测试

氯苯溶液中微生物来自研究区第四承压含水层的介质，其浓度的高低能够表征生物降解效果优劣。实验过程中微生物浓度值的确定采用分光光度法(OD660)，取氯苯水溶液过滤后放入比色皿，在660nm下使用UV－5800(PC)测定水样的吸光度。对OD660标准换算表中的吸光度与微生物浓度进行线性拟合，得到其换算公式(见图1)，将所测得的吸光度值带入换算公式，从而得到微生物的浓度，以每毫升溶液中所含菌体个数(107cfu/mL)表示。

表2 介质的颗分结果Table 2 Results of size grading of soil samples %

4 结果与讨论

生物降解过程研究的关键是回灌含水层中氯苯的生物降解动力学模式、降解的速率，温度和好氧与厌氧条件对降解速率及降解效果的影响。目前用于描述有机物生物降解过程的模型主要有底物消耗和微生物生长2种模型［11］。前者以一级衰减动力学模型(指数速率模型)最为常见;后者以Monod方程为代表。

图1 吸光度与微生物浓度的线性拟合Fig.1 Linear-fitting of absorbances and concentrations of microorganisms

4.1 一级衰减动力学模型

一级衰减动力学方程假设有机物的降解速率常数和溶质的浓度成正比，其表达式为

式中:C为被生物降解底物的浓度(μg/L);C0为初始氯苯的浓度(μg/L);λ为速率常数(d－1)。一级反应速率通常用化学物质的半衰期来表示，即

半衰期主要取决于底物性质、浓度和环境条件。

在基质浓度较低的情形下，降解速率与基质浓度成线性关系，符合一级衰减动力学方程，将式(1)取对数变为

根据实验结果绘制不同条件下氯苯降解曲线，并进行一级衰减动力学方程的拟合(图2、图3)，求得氯苯的衰减动力学参数见表3。

图2 好氧条件下一级衰减动力学方程拟合Fig.2 Fitted curves by first-order decay kinetics equation under aerobic condition

通过图2、图3以及表3可知，氯苯在3种不同温度以及好氧与厌氧条件下的生物降解作用均符合一级衰减动力学方程(R2min＞0.959)，氯苯在好氧与厌氧条件下的生物降解速率λ的大小顺序均为20℃＞10℃＞0℃;0，10℃条件下，好氧条件下的生物降解速率要略高于厌氧条件，而20℃时，好氧条件下的生物降解速率要略低于厌氧条件。相应的氯苯在好氧与厌氧条件下的生物降解半衰期t1/2的长短顺序为0℃＞10℃＞20℃。0，10℃条件下，厌氧条件下的生物降解半衰期要略长于好氧条件;而20℃时，厌氧条件下的生物降解半衰期要略短于好氧条件。说明了在好氧与厌氧条件下，温度的升高促进了生物降解反应的进行，降解速率提高，半衰期缩短;在相同温度条件下，溶解氧的增加对生物降解速率及半衰期的影响不明显。可见温度是此生物降解反应的主要驱动因子。

应用阿伦尼乌斯方程［12］可以将温度对生物降解速率的影响从定性分析到定量分析，阿伦尼乌斯方程为

图3 厌氧条件下一级衰减动力学方程拟合Fig.3 Fitted curves by first-order decay kinetics equation under anaerobic condition

表3 一级衰减动力学方程的系数Table 3 Coefficients of equations of first-order kinetics of decay

式中:A为指前因子;Ea为表观活化能(kJ/mol);R为摩尔气体常量(8.314 J/Kmol);T为绝对温度(K)。将式(4)取对数得

好氧与厌氧条件，根据3种不同温度下的λ，进行阿伦尼乌斯方程拟合，拟合结果如图4。好氧条件下，Ea=23.21 kJ/mol，A=6 307.5;厌氧条件下，Ea=24.27 kJ/mol，A=9 752.7。将其代入到式(4)，得到好氧与厌氧条件下温度与降解速率的关系式为

从这2个关系式中可以很明显看出，温度对于生物降解的正效应作用，温度升高降解速率加快。

图4 阿伦尼乌斯方程拟合Fig.4 The Arrhenius equation fitted

将好氧与厌氧条件下生物降解速率做商得到相同温度条件下的速率比值关系

令式(8)速率比值等于1，求得T=47.24℃，当温度小于47.24℃时，速率比值大于1。根据地下水人工回灌资料显示，回灌后温度最大为21.3℃，就式(8)得出的速率比值而言，相同温度条件下，好氧降解的速率快于厌氧。一级衰减动力学速率参数显示与计算的速率比值结论不完全一致，而一级衰减动力学模型并没有将生物降解过程中微生物浓度变化表征进来，因而需要引入微生物浓度的变化来进一步研究溶解氧对生物降解的影响。

4.2 Monod模型

1942年，Monod采用微生物在单一底物的培养基上进行实验，探讨特定温度、底物的类型及其浓度等条件下的微生物生长速度和底物浓度之间的关系［11］。Monod方程主要针对单一微生物。在假定各菌种间比例在生长过程中恒定的情况下，也可应用于混合菌群。该方程跨越了零级、混合级到一级的生物降解过程，是最为常用的生物降解动力学方程［13］。Monod 方程式为

式中:C为底物的浓度(μg/L);B为微生物的浓度(μg/L);qmax为基质最大比消耗速率(d－1);ks为半饱和系数(μg/L)。将微分方程式(9)用差分格式近似表示，采用线性化变换，则Monod方程可转化为

图5 20℃条件下氯苯的降解微生物曲线及B/Δ-1/C拟合曲线Fig.5 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves of B/Δ-1/C at 20℃

图6 10℃条件下氯苯的降解微生物曲线及B/Δ-1/C拟合曲线Fig.6 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves of B/Δ-1/C at 10℃

从氯苯降解曲线(图5至图7)来看，不同温度和好氧与厌氧下的氯苯的Ct/C0曲线在2 d内都是急速下降，主要是因为在前2 d内介质对氯苯的吸附是主要作用，达到吸附平衡后的主要作用变为生物降解作用，然后下降速度减慢，到完全被降解，完全降解的时间好氧与厌氧均为7 d(20℃)，9 d(10℃)，12 d(0℃)，温度升高促进了降解过程的进行。相同温度的氯苯降解曲线可以看出，好氧条件下氯苯的降解要略快于厌氧，溶解氧增加促进了生物降解的进行。

从微生物曲线(图5至图7)可以看出微生物在以氯苯作为唯一碳源，开始时候微生物增长得比较快，然后趋于缓慢到稳定，在降解完成时微生物的浓度(cfu/mL)为:好氧条件下9.3E+05(20℃)，8.7E+05(10℃)，7.9E+05(0℃);厌氧条件下5.6E+05(20℃)，5.0E+05(10℃)，4.1E+05(0℃)。好氧与厌氧条件下，从微生物增长的幅度和数量上都是20℃条件下更加明显，所以可以得出温度促进了微生物的生长，就这3种温度而言，显然20℃为微生物生长的最佳温度。而对于相同温度下，好氧条件下微生物的增长要快于厌氧，由此也可以看出溶解氧的增加促进了微生物的生长，使得生物降解反应的进行加快，效果更好。

根据拟合直线的方程，分别计算氯苯的最大比消耗速率qmax和半饱和常数ks，其结果见表4。

从表4可以看出，qmax在好氧与厌氧条件20，10，0℃ 下分别为1.1182，0.9957，0.8373d－1和0.928 0，0.8431，0.7540d－1，随着温度的升高基质最大比消耗速率提高表明氯苯的生物降解速率也随之提高。而对于相同温度下，好氧条件下基质最大比消耗速率要快于厌氧，溶解氧促进了微生物的生长，生物降解速率加快。ks在好氧与厌氧条件20，10，0℃ 下分别为291.28，293.11，295.38 μg/L和295.93，296.48，293.06μg/L。ks的大小表示微生物对基质的吸收亲和力大小，ks越大，微生物对基质的吸收亲和力越小，反之就越大［13］，而Monod模型中的ks的变化很小是由于反应过程中只有温度和溶解氧的变化没有基质的变化，微生物对基质的亲和力基本上没变，所以ks变化不明显。

图7 0℃条件下氯苯的降解微生物曲线及B/Δ-1/C拟合曲线Fig.7 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves B/Δ -1/C at 0℃

表4 Monod方程的系数Table 4 Coefficients of Monod equation

4.3 不同初始浓度下氯苯的生物降解

根据实验结果绘制不同初始浓度的氯苯降解量(Qe)的柱状图，一级衰减动力学方程的拟合只能针对浓度较低范围的，当浓度(C)增高到1 000μg/L以上时就不再适用了［11］。根据不同浓度条件下氯苯的降解量做出柱状图(图8)，从图中可以看出浓度低于500μg/L时，不同温度好氧与厌氧条件下的微生物对于氯苯均能降解完全，此后随着浓度的增加好氧与厌氧的降解量的关系均是20℃＞10℃＞0℃;相同温度，好氧条件下的降解量高于厌氧。根据柱状图的趋势预测最大的降解量为:好氧条件下35μg/g(20℃)，31μg/g(10℃)，28μg/g(0℃);厌氧条件下30μg/g(20℃)，27μg/g(10℃)，23μg/g(0℃)。随着氯苯初始浓度的逐渐升高，氯苯降解的量增加。这主要是由于微生物在降解过程中以氯苯作为唯一的碳源，较高浓度的氯苯更有利于微生物的富集，从而使培养初期微生物个体数量增加，生物降解更充分，降解的量增大。

图8 不同初始浓度下的生物降解量Fig.8 The amounts of biodegradation at different initial concentrations

虽然一级衰减动力学模型中溶解氧对降解速率及半衰期的影响不明显，但综合Monod的拟合结果以及不同浓度下的生物降解效果来看，温度升高和溶解氧的增加促进了生物降解速率的加快，提高了微生物降解氯苯的效果。就回灌过程中的温度和溶解氧的变化对生物降解的影响来看，选择夏天回灌，微生物降解氯苯的效果最好。

5 结论

(1)一定浓度条件下氯苯的生物降解反应符合一级衰减动力学和Monod方程，Monod方程得出，温度升高和溶解氧的增加，降解速率加快，降解效果更好。

(2)阿伦尼乌斯方程能够量化温度对生物降解速率的影响。

(3)不同浓度氯苯的生物降解计算出最大的降解量，在好氧与厌氧条件20，10，0℃下分别为35，31，28μg/g和30，27，23μg/g。

(4)就温度和溶解氧对氯苯生物降解的影响来看，回灌最佳季节是夏季。

［1］BOURI S，BEN DHIA H.A Thirty-Year Artificial Recharge Experiment in a Coastal Aquifer in an Arid Zone:The Teboulba Aquifer System(Tunisian Sahel)［J］.Comptes Rendus Geoscience 2010，342(1):60－74.

［2］HE Hai-yang，ZHANG Wen-jing.Risk Assessment of Organic Pollution of Artificial Recharge to Groundwater Environment［C］∥Proceedings of 2011 International Conference on Electric Technology and Civil Engineering(ICETCE).Lushan:ICETCE，2011，4:4437－4440.

［3］丁忠浩.有机废水处理技术及应用［M］.北京:化学工业出版社，2002:427－428.(DING Zhong-hao.Techniques of Organic Wastewater Treatment and Application［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2002:427－428.(in Chinese))

［4］瞿福平，张晓健，吕 昕，等.氯代芳香化合物生物降解性研究进展［J］.环境科学，1997，18(2):74－78.(QU Fu-ping，ZHANG Xiao-jian，LV Xin，etal.Advances on Research of Biodegradability for the Chlorinated Aromatic Compounds［J］.Environmental Science，1997，18(2):74－78.(in Chinese))

［5］冷守琴，魏 芳，张丽丽，等.一株氯苯降解新菌株的分离鉴定及其降解特性研究［J］.环境科学与技术，2011，34(2):6－11.(LENG Shou-qin，WEI Fang，ZHANG Lili，etal.Isolation，Identification，and Biodegradation Characteristics of a Novel Chlorobenzene Degrading Bacterial Strain［J］.Environmental Science and Technology，2011，34(2):6－11.(in Chinese))

［6］PARDUEJH，DELAUNERD，ADRIANDD，etal.Reductive Dechlorination of Hexachlorobenzene in Wetland Soils.Sorption and Degradation of Pesticides and Organic Chemicals in Soil［C］∥Proceedings of a Symposium Sponsored by Divisions S-3，S-1，S-2，and A-5 of the Soil Science Society of America and American Society of Agronomy，Madison，USA:Soil Science Society of America，1993:260.

［7］于海斌，王业耀，宋存义.生物降解氯苯的动力学模型研究［J］.环境科学研究，2011，24(3):268－272.(YU Hai-bin，WANG Ye-yao，SONG Cun-yi.Kinetic Models of Monochlorobenzene Microbial Degradation［J］.Research of Environmental Sciences，2011，24(3):268－272.(in Chinese))

［8］李明堂.第二松花江典型氯代烃类污染物的微生物降解研究［D］.长春:东北师范大学，2008.(LI Ming-tang.Microbiodegradation of Pollution of Chlorinated Hydrocarbons in the Second Songhua River［D］.Changchun:Northeast Normal University，2008.(in Chinese))

［9］甘 平，樊耀波，王敏健.氯苯类化合物的生物降解［J］.环境科学，2001，22(3):93－96.(GAN Ping，FAN Yao-bo，WANG Min-jian.Biodegradation of Chlorobenzenes(CBS)［J］.Environmental Science，2001，22(3):93－96.(in Chinese))

［10］许炉生，吴伟勇，卢 东，等.生物膜电极法降解氯苯、二氯苯的研究［J］.环境污染与防治，2011，33(1):71－73.(XU Lu-sheng，WU Wei-yong，LU Dong，etal.Degradation of Chlorobenzene and Dichlorobenzene by Biomembrane Electrode Method［J］.Environmental Pollution ＆ Control，2011，33(1):71－73.(in Chinese))

［11］张 岩.1，2，4－三氯苯在垃圾污染地下水中的迁移转化机理及模拟预测研究［D］.长春:吉林大学，2010.(ZHANG Yan.Mechanism of Movement and Transfer of in Polluted Groundwater and Simulating Prediction［D］.Changchun:Jilin University.(in Chinese))

［12］唐 顺，杨 琦，尚海涛，等.苯为好氧共代谢基质的1，1－二氯乙烯的生物降解研究［J］.环境科学学报，2011，31(10):2146－2153.(TANG Shun，YANG Qi，SHANG Hai-tao，etal.Biodegradation of 1，1-Dichloroethylene with Benzene as Anaerobic Metabolism Matrix［J］.Acta Scientiae Circumstantiae，2011，31(10):2146－2153.(in Chinese))

［13］张文静.佳木斯地区地下水、土中硝基苯迁移转化机理及其模拟预测［D］.长春:吉林大学，2007.(ZHANG Wen-jing.Movement and Transfer of Nitrobenzene in Soil and Groundwater in Jiamusi Area and Prediction Through Simulation［D］.Changchun:Jilin University，2007.(in Chinese ))