ITP患者脾切除前后外周血Th亚群细胞因子的变化及意义*

王 俊， 郑 冬， 张珑涓， 郑朝旭△

(中山大学附属第一医院1微创外科，2血液内科，3外科实验室，广东广州510080)

原发性免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)，原称特发性血小板减少性紫癜，是以抗血小板自身抗体介导的自身血小板在脾脏、肝脏、骨髓等单核巨噬细胞系统中破坏增多为特征的一种自身免疫性出血性疾病。ITP的发病机制尚未完全阐明，近年来不少研究表明除体液免疫机制外，细胞免疫机制不容忽视，其中活化的CD4+T淋巴细胞及其产生的细胞因子的平衡紊乱发挥着重要作用［1］。目前ITP患者的治疗首选糖皮质激素，但60%～70%患者激素治疗疗效欠佳。

脾脏是抗血小板自身抗体产生和血小板破坏的主要场所，脾切除术可以减少血小板自身抗体的产生以及血小板破坏，能迅速提升血小板，缓解病情，是治疗激素依赖型和激素无效型ITP的“金标准”。但目前脾切除术治疗ITP患者的细胞免疫功能状态的改变还不是很清楚。CD4+T淋巴细胞即辅助性T淋巴细胞(T helper lymphocyte，Th)，是人体免疫防御机制的核心环节，可通过分泌多种细胞因子进行免疫调控作用。国内外文献关于ITP患者脾切除治疗前后的Th亚群细胞因子的改变仅见个案报道［2］。本研究采用基于Luminex液相芯片技术的Quanti-Gene Plex(QGP)方法，检测脾切除术前后ITP患者和健康志愿者外周血Th1［白细胞介素－2(interleukin－2，IL－2)和干扰素 γ(interferon γ，TFN －γ)］、Th2(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)、Th3［转化生长因子 β1(transforming growth factorβ1，TGF－β1)］和Th17(IL－17)细胞因子mRNA表达水平的差异，探讨Th亚群细胞因子在ITP发病中的作用及脾切除术对Th亚群细胞因子功能状态的影响。

材料和方法

1 材料

1．1 研究对象 选择2009年4月～2011年6月入住中山大学附属第一医院微创外科成功完成腹腔镜脾切除术的ITP患者22例，男8例，女14例，中位年龄34(10～63)岁。所有ITP患者的诊断标准参照英国血液学学会发表的关于ITP的诊断标准［3］，所有患者初诊时血小板计数均＜100×109/L，经骨髓穿刺检查骨髓像符合ITP表现，并排除其它继发性血小板减少性疾病。术前所有患者均经过正规足量激素治疗。ITP患者脾切除术适应证为激素无效型和激素依赖型患者。健康体检者30例作为对照组，男18例，女12例，中位年龄43(25～82)岁。实验经本院伦理委员会审批通过，标本收集前均签署本人知情同意书。

1．2 主要仪器和试剂 Luminex 200检测平台(Luminex)、涡旋混合器(科学仪器股份有限公司)、Labnet温浴摇床(LabNet)、微孔板离心机(Eppendorf 5804R，Eppendoff)、微量离心机(Eppendorf 5415D，Eppendoff)、磁力架(Affymetrix);QuantiGene Plex 2．0试剂盒(Affymetrix);目的基因(IL－2、IFN －γ、IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、TGF－β1和 IL－17)和管家基因(PPIB和β－actin)的探针均由Affymetrix公司设计并合成。

2 方法

2．1 标本采集 在ITP患者脾切除术前3 d及术后7 d，清晨空腹抽取外周静脉血2 mL，放入含有枸橼酸钠抗凝剂的试管中，收集静置后直接放入－80℃冰箱中冻存备用，集中检测。对照组采血及保存方法同ITP患者。

2．2 QGP检测目的基因mRNA表达 应用QGP方法同时检测外周血8个细胞因子(IL－2、IFN－γ、IL－4、IL－5、IL －6、IL －10、TGF－β1和 IL －17)mRNA表达水平，实验操作严格按照说明书要求进行。使用QuantiGene plex 2．0样本处理试剂盒中的裂解液将全血样本裂解，使总RNA释放出来。然后将裂解后的样品分别加入96孔板的每个孔中，每孔加80 μL，并在每个孔中加入20μL稀释的探针磁珠试剂，然后将96孔板放入Labnet温浴摇床中54℃过夜杂交(18 h)。将杂交过夜后的混合物转移至固定于磁力架上的磁性分离板，用缓冲液洗涤3次，按步骤依次加入按比例稀释的Pre－Amplifier、Amplifier、Label probe，每一步完成后放入恒温摇床杂交1 h，温度控制在(50．0±0．5)℃，缓冲液洗涤3次，信号逐层放大。最后加入荧光底物，常温染色30 min，最后通过Luminex 200检测平台检测相对信号强度。以βactin为内参照，目的基因的检测值与β－actin的检测值相比之后得到的相对定量信号值作为该目的基因mRNA的相对表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 13．0 for Windows统计软件包(SPSS Inc)进行统计分析。计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示。一般资料中年龄比较应用t检验，性别比较应用χ2检验。术前和术后的数据的比较应用配对资料的符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)，术前和对照组、术后和对照组的数据比较应用两独立样本的秩和检验(Wilcoxon rank sum test)。细胞因子之间的相关性分析采用Spearman等级相关方法。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般资料比较

如表1所示，ITP患者与健康对照组之间的年龄及性别比构成差异均无统计学意义(P＞0．05)。

2 外周血Th1、Th2、Th3和Th17细胞因子的mRNA表达水平变化

2．1 Th1细胞因子 术前组外周血IL－2 mRNA水平显著低于对照组(P＜0．05);术后组IL－2 mRNA水平明显高于术前组(P＜0．05)，但仍低于正常对照组(P＜0．05)，见图1A。对照组、术前组和术后组外周血IFN－γmRNA水平的差异均无统计学意义(P＞0．05)，见图1B。

表1 ITP组和健康对照组之间的一般资料比较Table 1．Comparison of clinical data in ITPpatients and controls

Figure 1．The mRNA expression changes of Th cytokines in ITPpatients before splenectomy(Pre－op)and after splenectomy(Postop)．A:IL－2;B:IFN－γ;C:TGF－β1;D:IL－17．¯x±s．control:n=30;Pre－op:n=22;Post－op:n=22．*P＜0．05 vs control;△P ＜0．05 vs Pre－op．图1 ITP患者脾切除术前后Th细胞因子mRNA相对表达水平的变化

2．2 Th2细胞因子 对照组、术前组和术后组外周血Th2细胞因子(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)mRNA表达水平均非常低，基本低于试剂盒的检测范围下限。

2．3 Th3细胞因子 术前组和对照组之间TGF－β1mRNA水平差异无统计学意义(P＞0．05);术后组TGF－β1mRNA水平显著高于术前组及对照组(P＜0．05)，见图1C。

2．4 Th17细胞因子 术前组IL－17 mRNA水平显著高于对照组(P＜0．05);术后组IL－17 mRNA水平与术前组之间的差异无统计学意义(P＞0．05)，但术后组的IL－17 mRNA水平仍明显高于对照组(P ＜0．05)，见图1D。

3 ITP患者细胞因子之间的相关性

对术前和术后4种细胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β、IL－17)mRNA相对表达量之间进行相关性分析。如表3所示，ITP患者术前IL－2与IFN－γ之间呈正相关(r=0．647，P ＜0．01)，其它细胞因子之间均无明显相关性(P＞0．05)。

表3 术前ITP患者的细胞因子mRNA表达水平之间的相关性分析Table 3．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP preoperative patients

ITP患者术后3对细胞因子之间呈正相关，分别是 IL－2与IFN －γ(r=0．787，P ＜0．01)，IL－2与IL－17(r=0．554，P ＜0．01)，IFN －γ 与 IL －17(r=0．461，P ＜0．05);其它细胞因子之间均无明显相关性(P ＞0．05)，见表4。

表4 术后ITP患者的细胞因子mRNA表达水平之间的相关性分析Table 4．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP postoperative patients

讨 论

ITP是一种自身免疫性的器官特异性血液病，主要是由于抗血小板自身抗体介导的血小板破坏或者血小板生成受损所导致。自身反应性B淋巴细胞分泌自身抗体被认为是经典的ITP发病机制，但是B细胞产生抗体需要特异性自身反应性T细胞的辅助。因此，活化的CD4+Th细胞及其产生的细胞因子失衡在ITP发病中的作用越来越受到重视。本团队前期研究初步发现了ITP患者的外周血T细胞亚群(主要是CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞)存在异常以及脾脏细胞免疫存在异常［4－5］。为进一步深入研究ITP患者CD4+T淋巴细胞(Th)分泌的细胞因子的功能状态及脾切除术对细胞因子的影响，我们检测了脾切除术前后外周血CD4+T淋巴细胞分泌的8种主要细胞因子mRNA表达情况。

CD4+Th淋巴细胞根据分泌细胞因子种类的不同，通常可以分为3个细胞亚群:Th1、Th2和Th3亚群。Th1细胞主要是产生IL－2和IFN－γ等细胞因子，参与巨噬细胞活化过程，介导细胞免疫;而Th2细胞主要是产生IL－4、IL－5、IL－6和IL－10等细胞因子，诱导抗体生成，介导体液免疫。Th3细胞主要通过分泌免疫调节因子TGF－β1，下调抗原提呈细胞，其功能与免疫耐受诱导密切相关。最近发现的一种新的效应性CD4+T细胞亚群，以分泌IL－17为特征，因此被命名为Th17细胞，已发现其在防御胞外菌感染、介导慢性炎症、自身免疫性疾病和肿瘤发病中发挥重要作用。

正常情况下，Th1和Th2细胞亚群的平衡对调节免疫系统是非常必要的，多种自身免疫性疾病均存在Th1/Th2细胞亚群比例的失衡。多数研究表明ITP主要表现为Th1细胞占优势和Th1细胞因子活化模式［6－7］，也有研究者持中立态度［8］或反对这种观点［9］。而在本研究中，术前ITP患者IL－2 mRNA表达水平较对照组下降，提示ITP的发病可能与Th1细胞因子被抑制有关。经过脾切除后，IL－2 mRNA水平有所升高，但仍低于正常对照组，说明经过手术治疗，机体的免疫功能有所恢复，但IL－2尚未完全恢复至正常水平。Andersson等［8］应用 ELISA方法检测ITP患者和健康对照组的血清细胞因子水平，发现两组IL－2、IFN－γ和IL－4表达水平均无法检测出，低于试剂盒的检测下限，这与本研究的部分结果有一定相似性。

Th3细胞因子TGF－β1被认为是B细胞增殖和抗体分泌的一个重要的抑制因子，且TGF－β1还可抑制T细胞增殖及阻止Th1和Th2细胞介导的自身免疫性疾病的发生。Gorelik等［10］发现TGF－β1是维持自身免疫系统稳定的一个关键负调节者，TGF－β1的减少导致自身免疫反应的激活。Andersson等［8］发现慢性ITP缓解期患者相对于活动期患者和健康对照组TGF－β1的表达水平更高，认为TGF－β1在疾病缓解期介导的旁路免疫抑制效应可能发挥重要作用。他们随后的研究又发现ITP患者活动期外周血单个核细胞(PBMC)生成TGF－β1减少［11］。Fahim等［12］报道，急性和慢性ITP患者TGF－β1mRNA表达水平均明显低于正常对照组，慢性ITP活动期患者的TGF－β1mRNA水平显著低于缓解期患者。这些研究结果提示，慢性ITP活动期可能与Th3反应的下调有关，而病情缓解可能是由于Th3反应上调所引起。本研究对象均为经过正规足量激素治疗的慢性患者，术前病情已经得到部分缓解。检测结果发现，术前组TGF－β1mRNA表达水平与正常对照组无显著差异，与上述研究结果基本吻合。术后患者TGF－β1mRNA水平较术前组及对照组均明显升高，提示脾切除术可上调TGF－β1基因表达水平，发挥旁路免疫抑制效应，激活Th3反应，从而进一步使患者病情得到缓解。

研究发现，Th17细胞可介导多种自身免疫性疾病，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、胶原诱导性关节炎、炎症性肠病等，而这些疾病过去都被认为主要是由Th1细胞及其产生的细胞因子所介导。此外，有越来越多的研究将焦点放在明确Th17细胞在器官特异性疾病的发病机制中所起的作用;已有研究证明Th17细胞比Th1细胞在诱导自身免疫性疾病方面更有效也更有影响力。细胞因子IL－17也被发现在人类多种自身免疫性疾病中是增高的，包括类风湿关节炎、多发性硬化症和银屑病等。而IL－17与ITP的相关研究较少，且得出的结论存在不统一。Guo等［13］和 Ma等［14］研究认为 ITP 的发病与 IL －17无明显关系;而 Wang 等［15］和 Rocha 等［16］研究发现ITP患者血清IL－17蛋白水平升高。本研究结果显示，ITP患者术前和术后的IL－17 mRNA表达水平均较对照组升高，但术前和术后无显著差异，提示IL－17在ITP发病中可能具有非常重要的作用，但脾切除治疗短时间内并不能下调IL－17 mRNA表达水平。

本研究对ITP患者术前和术后4种细胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β和IL－17)之间的相关性进行分析，发现术前和术后IL－2和IFN－γ均成正相关，可能是由于Th1细胞因子之间存在协同作用。术后ITP患者的IL－17与IFN－γ、IL－2之间均成正相关，提示ITP患者的Th1和Th17细胞因子之间可能也存在相互影响的作用。

目前多采用RT－PCR传统方法检测基因mRNA表达水平，但由于步骤繁琐、易受干扰等因素等影响了检测结果的准确性。mRNA表达的准确性和敏感性对于基因研究尤为重要，所以本研究选择采用基于b－DNA技术和Luminex液相芯片技术的QuantiGene Plex(QGP)方法。其优势是直接从全血样本中检测目的基因表达，而且可在同一反应孔中同时对多个基因进行精确定量。它无需抽提纯化、无需逆转录、无需PCR扩增，只需要简单的细胞溶解过程，经探针杂交与信号放大即可快速得到比RTPCR更加精确的定量结果，因而避免了很多人为因素对实验的干扰。实践证明，QGP技术在精确度、准确性、重现性等方面均优于RT－PCR，并且与RTPCR有良好的相关性［17］。提示QGP技术可以作为检测基因表达水平的高通量、多样本的手段，可应用于临床和实验研究。目前国内外尚未见到将QGP技术应用于ITP研究中的报道。

总之，本研究发现，手术前ITP患者IL－2表达较正常对照明显降低，IL－17表达较正常对照明显上升，而IFN－γ和TGF－β1较正常对照无明显差别。脾切除术治疗后，TGF－β1表达较治疗前明显升高;IL－2表达较治疗前有所升高，但仍低于正常对照;而IFN－γ和IL－17较治疗前无明显差别。本研究表明，ITP患者存在Th亚群细胞因子表达失衡，脾切除术治疗作为激素依赖或无效的ITP患者的有效手段，可改善ITP患者部分Th亚群细胞因子的失衡。

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