石见穿多糖抑制人胃癌细胞系MGC-803细胞迁移及其机制的初步研究

朱红岩 孙玉国 曲杰 卞永生 .承德医学院，河北承德 067000；.承德医学院附属医院，河北承德 067000；3.河北省保定市第一医院，河北保定 07000

石见穿多糖抑制人胃癌细胞系MGC-803细胞迁移及其机制的初步研究

朱红岩1孙玉国1曲杰2卞永生3▲1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院，河北承德 067000；3.河北省保定市第一医院，河北保定 071000

目的观察石见穿多糖对人胃癌细胞系MGC-803细胞迁移能力的影响，并探讨其作用机制。方法利用水萃取法制备石见穿多糖，通过划痕实验、Transwell实验观察不同浓度对石见穿多糖同样条件培养下胃癌MGC-803细胞迁移能力的影响，并采用Western blot方法检测不同浓度石见穿多糖对MGC-803细胞内白介素8（IL-8）蛋白表达水平的影响。结果同未加药物对照组相比，经高浓度石见穿多糖（50、100 g/L）处理后，MG-63细胞的划痕愈合能力明显减弱，穿膜细胞的数量显著减少；同时，细胞内IL-8蛋白的表达水平明显降低，并与石见穿多糖的浓度有关。结论石见穿多糖抑制了胃癌MGC-803细胞的迁移能力，其作用与抑制MGC-803细胞内的IL-8蛋白表达水平有关。

石见穿多糖；MGC-803细胞；白介素8；迁移

石见穿为唇形科植物华鼠尾Salvia chinensis Benth.的全草，味苦、辛，性平，具有清热解毒、活血镇痛的功能。临床上多用于治疗黄疸型肝炎、癌症、肾炎、痛经等[1]。动物实验证明，石见穿能抑制或杀灭癌细胞，使患病小白鼠生存期显著延长，能增强实验动物的免疫功能[2]。到目前为止，从石见穿全草中分离出的包括多糖类、三萜类、甾醇类、多酚类等化学成分已达33种之多[3]，其中石见穿多糖（Salvia chinensis Benth.Polysaccharides，SBP）是石见穿的重要活性成分之一，具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤的功能[4]。近年来对石见穿多糖抗肿瘤作用的研究主要是其抑制肿瘤的增殖[5-6]，关于其抑制肿瘤细胞迁移功能的研究报道较少。本研究旨在观察石见穿多糖对人胃癌细胞系MGC-803细胞体外迁移能力的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人胃癌MGC-803细胞，由承德医学院附属医院中心实验室提供。

1.1.2 药物石见穿药材购自河北安国市药材市场，由承德医学院赵春颖副研究员鉴定为为唇形科鼠尾草植物紫参Salvia chinensis Benth.的全草，样品保留在承德医学院中药研究所。

1.1.3 试剂RPMIMedium1640培养基干粉和胎牛血清（FBs）购自GIBCO公司，胰蛋白酶购自Amersco公司产品，IL-8及β-actin抗体购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥公司。

1.1.4 仪器Primo R型低温高速离心机（德国Heraeus公司），CO2培养箱（美国Forma公司），倒置荧光显微镜（Zeiss公司），HFsafe-1500型生物安全柜（HEAL FORCE公司），Transwell小皿（Millipore公司），3633型高压消毒锅（美国Yamato scientificwc公司），HP-8453紫外-可见分光光度计（惠普公司），梅特勒-托利多AG245电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将MG-XX细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中，用含10%胎牛血清以及青、链霉素各100 U/mL的RPM1640培养液培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 石见穿多糖制备根据文献[7]，称取适量石见穿。用石油醚于索氏提取器回流5 h，脱去叶绿素等脂类。按水浴温度90℃，料液比为1∶10，提取时间2.5 h，提取4次作为提取工艺，进行回流浸提，冷却后过滤，合并上清液，浓缩后加入无水乙醇，使浓度达到80%得沉淀。沉淀用Savage法去除蛋白5次，再依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤，减压干燥得黑色粗多糖粉末。

1.2.3 细胞形态学观察将MGC-803悬液接种于6孔培养板，每孔1mL，分别加入100μL不同浓度（100、50、25、12.5 g/L）的石见穿多糖溶液及等量PBS作为对照，常规培养。培养24 h后于倒置相差显微镜下直接观察培养板中肿瘤细胞形态特征。所有浓度下的培养均重复3次，以典型结果作为最终数据。

1.2.4 细胞划痕实验将MGC-803细胞铺满6孔培养板，待细胞贴壁长满后进行划痕，PBS洗一遍，更换为无血清培养基，分别在0 h和24 h后观察划痕距离并拍照。

1.2.5 Tr answe l l实验取指数生长期的MGC-803细胞，胰酶消化，RPM1640培养基制备细胞悬液，进行细胞计数。调整细胞数为每100μL悬液含5×104个细胞进行铺板。24孔培养板中每孔加入600μL含15%小牛血清的RPM1640完全培养基，在Transwell小室的上室分别加入100μLMGC-803细胞悬液，各含5×104个细胞，最后上室加入10μL 1% BSA，使BSA最终浓度为0.1%，以保持上室内的渗透压。加入不同浓度的石见穿多糖100μL，37℃、5%CO2培养箱常规培养15 h。取出小室用90%乙醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察并拍照，随机选取4个低倍视野（×400）进行细胞计数，并计算平均值。实验重复3次。

1.2.6 Wes t e r n b l o t实验分别取石见穿多糖处理前后的MGC-803细胞均约5×106个，加入300μL细胞裂解液，冰上裂解30min后转移至1.5mL EP管中，12 000 r/min 4℃离心4min，取上清液置于-20℃保存。BCA法测定蛋白浓度。每个泳道上样蛋白量为40μg，上样于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE电泳），80V电泳30 min，120 V电泳90 min，电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜，用新鲜配制的含5%脱脂奶粉的PBST液摇床上封闭2 h，加入IL-8抗体（1∶500）及抗β-Actin抗体（1∶500），4℃反应过夜。然后将膜取出，用PBST液洗涤3次，每次15 min，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000）室温封闭1 h，然后用PBST液洗涤3次，每次10 min，最后用化学发光法检测，X线片记录结果。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞形态学变化

正常培养条件下生长的MGC-803细胞形态规则，轮廓清晰，胞体透亮，贴壁良好；而以50 g/L和100 g/L石见穿多糖处理后，肿瘤细胞生长缓慢，胞体皱缩，部分细胞破碎，总体呈分散悬浮生长，贴壁现象减弱甚至消失。当使用较低浓度石见穿多糖处理MGC-803细胞时，其生长表型同正常细胞没有明显变化。见图1。

2.2 划痕实验

划痕实验中通过划痕愈合程度的比较可以判断石见穿多糖对MGC-803细胞迁移能力的影响情况。相同条件培养24 h后，未经石见穿多糖处理的MGC-803细胞运动迁移基本完全覆盖了划痕区域。相反的，加入石见穿多糖以后，MGC-803细胞的迁移能力明显减弱，细胞间划痕的距离缩短趋势减缓，并且石见穿多糖浓度越高MGC-803细胞的迁移受阻越明显。方差分析结果显示，石见穿多糖处理组在作用24 h与未加药物的对照组（石见穿多糖浓度为0）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 Transwell实验

相较于未进行药物处理的MGC-803细胞，不同浓度的石见穿多糖处理后穿膜细胞的数量均减少，且呈现浓度相关性。结果采用方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 W estern blot实验

已有证据表明细胞因子IL-8参与肿瘤细胞的迁移过程，本研究通过Western blot对石见穿多糖处理的人胃癌MGC-803细胞中IL-8蛋白水平的变化进行了检测。结果显示，经石见穿多糖处理过的MGC-803细胞中IL-8蛋白表达水平较对照组明显降低，其蛋白总量随着石见穿多糖浓度的增加而减少。见图2。

表1 不同浓度的石见穿多糖对人胃癌MGC-803细胞迁移能力的影响

表2 不同浓度的石见穿多糖对人胃癌MGC-803细胞穿膜能力的影响

3 讨论

研究表明，胃癌细胞的转移过程伴随着多种细胞因子的异常表达[8]。细胞因子是由多种细胞产生，具有广泛调节功能的多肽分子，参与调控细胞的增殖分化及细胞间的相互作用[9]。根据产生细胞种类和功能的不同，细胞因子可分为多种，且肿瘤细胞亦可合成或分泌其中部分种类的细胞因子[10]。

IL-8是1987年Yoshimur发现的第一个趋化因子，它通过激活和趋化嗜中性粒细胞，在多种炎症反应中发挥作用[11]。近年研究发现，IL-8与肿瘤组织密切相关，在支气管原位癌、肺癌、肝癌等肿瘤组织中均检测到IL-8mRNA及蛋白表达。已有实验及临床数据显示，正常胃黏膜→癌前状态→胃癌的发生过程中IL-8蛋白阳性表达率逐渐升高[12]。有学者通过体外实验发现：IL-8促进肝癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞等细胞的迁移、侵袭力[13-15]。

我国是天然药物大国，应用中草药治疗肿瘤历史悠久，许多中药材因具有抗肿瘤作用被深入研究[16-18]。现代药理研究表明，石见穿具有抗肿瘤效果，常与其他药物配合使用，应用于肝癌、直肠癌及妇科肿瘤的治疗。石见穿全草水提取物主要成分为石见穿多糖，有多种生理活性，如抗菌、抗炎及抗肿瘤等[4]。然而，对其抗肿瘤机制方面的研究较少，本研究中，笔者以人胃癌MGC-803细胞为评价体系，初步研究石见穿多糖对人胃癌细胞转移能力的影响，并对其中的相关机制作出了初步揭示。

本研究结果显示，石见穿多糖对人胃癌MGC-803细胞的迁移有明显的抑制作用，且其与用药浓度呈正向相关。同时，迁移能力减弱细胞中细胞因子IL-8的表达被强烈抑制。据此，笔者推测石见穿多糖抑制人胃癌MGC-803细胞的迁移与其抑制细胞内IL-8蛋白表达水平有关，这也符合已有的研究结果。关于石见穿多糖的化学结构与人胃癌MGC-803细胞核酸构成和蛋白质空间结构的改变正在进一步研究。

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Effect of the Salvia chinensis Benth.Polysaccharides on themetastasis ability of human gastric cancer cells(MGC-803 cells)

ZHU Hongyan1 SUN Yuguo1 QU Jie2 BIAN Yongsheng3▲
1.Chengde Medical University，Hebei Province，Chengde 067000，China;2.The Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Hebei Province，Chengde 067000，China;3.The First People′s Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071000，China

ObjectiveTo investigate theeffectof Salvia chinensis Benth.Polysaccharides(SBP)on themetastasisability ofhuman gastric cancer cell line(MGC-803 cells)in vitro,and to explore the action mechanisms of SBP.MethodsSBP prepared by extraction ofwater,the effect of the different concentration of SBP on the experimentalmetastasis ability of MGC-803 cellswas observed by scratch test and Transwellmetastasis experiments.The level of IL-8 protein in MGC-803 cells were detected by Western Blotting.ResultsCompared with control group(no drug),SBP(50 and 100 g/L)inhibited the MGC-803 cells wound,MG-63 cells scratches healed was significantly weakened,number of cells passing through filter membrane would decrease.The level of IL-8 protein in MG-63 cells decreased significantly after treated with SBP and correlation with the concentration of SBP.ConclusionSBP ia able to inhibit themetastasis ability of MGC-803 cells.The actionmechanisms of SBP are related to the inhibition of IL-8 protein levels in MGC-803 cells.

Salvia chinensis Benth.Polysaccharides;MGC-803 cells;IL-8;Metastasis

R730.52

A

1673-7210（2012）11（b）-0005-03

朱红岩（1987-），男，承德医学院2010级在读硕士研究生，从事肿瘤细胞增殖和迁移方面的研究。

▲通讯作者

2012-06-12 本文编辑：谷俊英）