准分子激光原位角膜磨镶术后泪液中神经生长因子表达与角膜知觉恢复的研究

牛广增 苏 蕊 范玉香 陈海婷 黄新莉

准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis，LASIK)是目前角膜屈光手术的主流手术方式。随着手术患者不断累积，术后并发症也逐渐显现，其中眼干、眼涩等症状比较突出，有调查显示其发病率为3%～58%。LASIK术后眼干燥症与角膜神经损伤导致角膜知觉减低有关，术中板层刀制作角膜瓣时会切断角膜大部分上皮下神经丛，可导致术后角膜知觉减退，影响泪液分泌及泪膜形成。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种小分子多肽类神经营养因子，能够促进角膜上皮细胞增生和移行，还可通过刺激多种神经肽及其他生长因子的释放来促进神经再生。人角膜上皮细胞、内皮细胞、角膜缘干细胞及基质细胞均能合成并分泌NGF。对于LASIK术后角膜知觉减退和泪液中NGF含量变化两者间的相互作用关系，现有的文献报道不尽相同，术后泪液中NGF含量变化趋势是先降低后恢复到正常还是先升高再恢复到正常尚存有争论。因此，本研究拟通过测定LASIK术后患者泪液中NGF含量、角膜上皮下神经丛密度、角膜知觉、泪液分泌量、BUT等指标，探讨术后泪液分泌量、泪膜破裂时间(break up time，BUT)、角膜知觉、角膜上皮下神经丛密度4者与泪液中NGF含量的相互关系，为NGF在LASIK术后的临床应用提供参考依据，为规范预防和治疗眼干燥症提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年6月至12月在我院行LASIK的患者107例(214眼)，男47例(94眼)，女60例(120眼)，年龄18～35(22.2±4.5)岁，术前等效球镜度数为 －2.00～－6.00(－3.70 ±1.80)D。入选病例均符合以下标准:(1)屈光状态稳定2 a以上;(2)眼压 ＜21 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg);(3)未戴过角膜接触镜;(4)无角膜炎、青光眼、瘢痕体质、糖尿病等LASIK手术禁忌证;(5)没用过影响泪液分泌及泪膜稳定性的药物;(6)中央角膜厚度500～600 μm;(7)双眼屈光参差 ＜1.00 D。

1.2 主要仪器 法国 LUNEAU公司的 Cochet-Bonnet角膜触觉计;日本 NIDEK公司的 Confoscan4.0型角膜共焦显微镜和准分子激光仪器Nidek-EC-5000CXⅡ;法国Moria公司Moria2旋转板层刀(110刀头)。

1.3 手术方法 患者双眼均常规行LASIK手术，角膜瓣蒂位于上方，瓣厚度为110～130 μm，术中用生理盐水冲洗角膜创面，术后可乐必妥眼液滴双眼每天4次，持续1周;艾弗龙眼液滴双眼每天4次，以后每周递减1次，直至停药。手术均由同一医师进行。患者无并发症出现。

1.4 观察指标及方法 分别测定双眼术前及术后1 d、1个月、3个月时以下指标(所有指标均由未参与试验设计的同一人测定):(1)泪液分泌量和BUT:同等环境下在颞下方球结膜囊内放置5 mm×30 mm泪液检测滤纸(天津晶明新技术开发有限公司)，轻闭眼，5 min后取出滤纸条，记录湿润位置刻度数值即为该眼泪液分泌量。然后将荧光素钠眼液滴入结膜囊，眨眼两次后在裂隙灯钴蓝光下记录一次瞬目后角膜表面泪膜出现干斑所需时间(用秒表计时)，重复测量3次后取平均值即为该眼BUT。(2)角膜上皮下神经丛密度:共焦生物显微镜下1次检查获得角膜中央点自内皮层至上皮层约300帧图像，每帧图像有效的侧像分辨率为1 μm，景深为10 μm，水浸式物镜的扫描范围为340 μm×255 μm，放大倍数为1000倍。以每帧图内可分辨出的上皮下神经丛神经纤维总长度为该测定点的神经丛密度，以神经丛密度最大一帧图为计数图，记录该眼角膜上皮下神经丛密度。(3)角膜知觉:触觉计尼龙纤维丝直径0.12 mm，长度0～60 mm。测定角膜中央点的知觉阈值。告知患者检查过程及步骤，消除患者紧张情绪后，在裂隙灯下嘱其双眼直视前方，自然睁眼，尼龙丝垂直接触角膜中央，以尼龙丝开始弯曲为一次完整接触，用每一尼龙丝长度测定3次，3次中有2次出现眨眼动作即为阳性，尼龙丝从60 mm长度开始检测，每次递减5 mm，有阳性反应的最大纤维长度即为该点角膜知觉数值。当尼龙丝长度小于5 mm时，角膜触觉数值记为0 mm。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以±s表示;样本不同时段相应变量、不同部位相应变量均数间的比较均采用配对资料的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泪液中NGF含量、角膜上皮下神经丛密度、角膜知觉、泪液分泌量、BUT术前术后对比 术后1 d，各观察指标除泪液中NGF含量外均较术前大幅降低(均为P＜0.05)，NGF含量较术前明显升高(P＜0.05);术后1个月变化情况与术后1 d相同;术后3个月，泪液中NGF含量、泪液分泌量、BUT与术前相比差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，角膜上皮下神经丛密度和角膜知觉较术前仍偏低(均为P＜0.05;见表 1)。

2.2 角膜上皮下神经丛在共焦显微镜下形态学表现 术前中央测定点角膜上皮下神经丛密度高，与背景对比明亮，中等粗长，多均匀平行排列，神经串珠、分叉、吻合支多见(图1A);术后1 d，角膜上皮下神经丛密度较术前明显减低，神经也多短细(图1B);术后1个月，角膜上皮下神经丛密度较术后1 d未见明显提高，神经纤维极少见(图1C);术后3个月，角膜上皮下神经丛密度均较术后1个月明显提高，再生神经暗淡、短细，神经串珠、分叉、吻合支偶见(图1D)。

术前角膜前基质细胞致密、粗大、明亮，有时见神经干走行其间，可见星形粗大神经干分支(图2A);术后1 d，角膜前基质细胞紊乱、细胞核反光增强，可见神经干断端(图2B);术后1个月，角膜前基质深层中可见粗大神经断端开始膨大，神经再生(图2C);术后3个月，前基质中可见神经干断端再生及神经分支再生(图2D)。

Figure 1 Manifestations of central corneal subepithelial nerve plexus under confocal microscopy.A:Preoperative manifestation(Arrow showed nerve fibers);B:Postoperative manifestation at 1 day;C:Postoperative manifestation at 1 month;D:Postoperative manifestation at 3 months(Arrow showed the regeneration of nerve fibers) 手术前后角膜上皮下神经丛在共焦显微镜下形态学表现。A:术前角膜上皮下神经丛(箭头示神经纤维);B:术后1 d角膜上皮下神经丛;C:术后1个月角膜上皮下神经丛;D:术后3个月角膜上皮下神经丛(箭头示再生神经纤维)

Figure 2 Manifestations of stroma nerve plexus under confocal microscopy(Arrow showed nerve fibers).A:Preoperative manifestation;B:Postoperative manifestation at 1 day;C:Postoperative manifestation at 1 month;D:Postoperative manifestation at 3 months 手术前后角膜基质神经丛在共焦显微镜下形态学表现(箭头示神经纤维)。A:术前角膜基质神经;B:术后1 d角膜基质神经;C:术后1个月角膜基质神经;D:术后3个月角膜基质神经

3 讨论

角膜是全身神经末梢最多的部位，其感觉神经由睫状神经发出，自脉络膜上腔进入巩膜前行，进入角膜基质形成基质神经丛，然后发出分支在前弹力层下相互吻合构成上皮下神经丛，该神经丛发出分支走行于上皮基底细胞之间，再发出神经末梢形成上皮内神经丛，使角膜表面有着敏锐的知觉。其中尤以角膜中央区(角膜中央直径4 mm区域)及旁中央区(角膜中央区外2 mm区域)神经密度最高，知觉最为敏锐[1]。LASIK术中会损伤这些区域的神经丛，导致角膜知觉减退，本研究结果也证实了这一点。国外Lee等[2]认为LASIK术后6～12个月时角膜神经密度才开始增加。也有研究发现角膜中央上皮下神经丛术后1 a未完全恢复[2-3]。即使术后2 a上皮下神经丛密度接近术前水平，术后3 a时再次检查发现角膜神经丛密度还会再次降低[4]，可见LASIK术后角膜上皮下神经丛损伤后再恢复是一个复杂漫长的过程，有待更多的观察研究。

眼干燥症是LASIK术后普遍存在的并发症之一，临床工作中用泪液分泌量和BUT来评价眼干燥症的严重程度。本研究结果显示，术后1 d时泪液分泌量和BUT分别下降到术前的45%和10%左右，术后3个月时二者恢复到术前水平。导致术后泪液分泌量和BUT下降的原因有很多，包括角膜神经的损伤、角膜上皮的损伤、负压环和角膜板层刀对角膜表面微绒毛和微皱壁及脊样突起的损伤、结膜杯状细胞的损伤等。本研究暂只讨论手术对角膜神经损伤所起的作用。在本研究中我们发现，术后3个月时泪液分泌量和BUT已恢复到术前水平而角膜知觉仍低于术前水平。我们推测LASIK术后早期角膜知觉减退只是导致泪液分泌量减少的因素之一，也可能与本研究中测得的患者泪液分泌量是由基础泪液(由副泪腺分泌)和刺激性泪液(泪腺由于外界刺激而分泌)两部分构成有关。术后早期角膜知觉减退导致刺激性泪液分泌减少，术后3个月时角膜中央知觉尚未恢复到术前水平，但角膜上方知觉因为角膜瓣蒂的角膜神经损伤较小而较早恢复，足以使刺激性泪液分泌量恢复到术前水平。Patel等[5]观察了LASIK术前、术后下睑泪河宽度发现，二者差异无统计学意义，也间接证明了上述推测。LASIK术中使用板层刀制作角膜瓣时会切断角膜大部分上皮下神经丛，可导致术后角膜知觉减退，引起瞬目减少，减低角膜上皮的有丝分裂率，延缓角膜上皮愈合，进而影响泪膜重建，导致BUT减低。有研究认为瞬目动作是泪膜重建的基础，而瞬目次数与角膜中央知觉呈正相关[6]。本研究结果也显示术后角膜知觉的恢复趋势与BUT相同，均为先降低后逐渐恢复正常。

在促进LASIK术后角膜上皮下神经再生的各项研究中，NGF相关药物的应用是目前研究的热点之一。NGF是一种小分子多肽类神经营养因子，能够促进角膜上皮细胞增生和移行，并可调节角膜缘干细胞的分化和增生，还可通过刺激多种神经肽及其他生长因子的释放来促进神经再生，加快角膜愈合过程[6]。有研究发现人角膜上皮损伤后与上皮细胞结合的NGF数量明显增加[7]。本研究结果显示术后1 d时泪液中NGF含量较术前明显增加，这与Lee等[8]的研究结果一致。推断其原因可能是LASIK术中板层刀制作角膜瓣时切断上皮下神经丛，损伤角膜上皮和前基质，刺激角膜组织反射性分泌NGF，导致术后患者泪液中NGF含量升高。本研究中术后1 d时泪液中NGF含量明显升高，泪液分泌量、BUT、角膜中央上皮下神经丛密度和角膜知觉明显降低，术后3个月时NGF、泪液分泌量和BUT三者均恢复到术前水平，而角膜中央上皮下神经丛密度和角膜知觉只分别恢复到术前的50%和70%左右。分析其原因可能是由于LASIK术后3个月时角膜上皮、角膜基质、结膜等组织已大部分恢复到术前水平，导致泪液分泌量减少、BUT降低和刺激NGF分泌的因素已大部分消失所致。多项研究证明NGF能够促进角膜伤口愈合和角膜神经再生[9-11]。但尚未见有关NGF眼液应用于临床的报道，我们将密切关注最新药物研究进展。

1 王 礡，刘汉强，王 洋，马小力.正常人角膜不同位置角膜知觉的测定分析[J].中华眼科杂志，2003，39(7):436-438.

2 Lee BH，McLaren JW，Erie JC，Hodge DO，Bourne WM.Reinnervation in the cornea after LASIK[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(12):3660-3664.

3 Patel SV，McLaren JW，Kittleson KM.Subbasal nerve density and corneal sensitivity after laser in situ keratomileusis:femtosecond laser vs mechanical microkeratome[J].Arch Ophthalmol，2010，128(11):1413-1419.

4 Calvillo MP，McLaren JW，Hodge DO，Bourne WM.Corneal reinnervation after LASIK:prospective 3-year longitudinal study[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(11):3991-3996.

5 Patel S，Alió JL，Artola A，Martinez MJ.Tear volume and stability after LASIK[J].J Refract Surg，2007，23(3):290-298.

6 Dobrowsky RT，Carter BD.P75 neurotrophin receptor signaling:mechanisms for neurotrophic modulation of cell stress[J]?Neurosci Res，2000，61(3):237-243.

7 Sornelli F，Lambiase A，Mantelli F，Aloe L.NGF and NGF-receptor expression of cultured immortalized human corneal endothelial cells[J].Mol Vis，2010，29(16):1439-1447.

8 Lee HK，Lee KS，Kim HC，Lee SH，Kim EK.Nerve growth factor concentration and implications in photorefractive keratectomy vs laser in situ keratomileusis[J].Am J Ophthalmol，2005，139(6):965-971.

9 Lambiase A，Mantelli F，Bonini S.Nerve growth factor eye drops to treat glaucoma[J].Drug News Perspect，2010，23(6):361-367.

10 Cellini M，Bendo E，Bravetti GO，Campos EC.The use of nerve growth factor in surgical wound healing of the cornea[J].Ophthalmic Res，2006，38(4):177-181.

11 Joo MJ，Yuhan KR，Hyon JY，Lai H，Hose S，Sinha D，et al.The effect of nerve growth factor on corneal sensitivity after laser in situ keratomileusis[J].Arch Ophthalmol，2004，122(9):1338-1341.