177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内的生物分布和兔SPECT显像研究

邓新荣，向学琴，李凤林，樊彩云，刘子华，陈 阳，罗志福，

（1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京 102413；2.中国原子能科学研究院 核工业401医院 核医学科，北京 102413）

恶性肿瘤患者发生骨转移的几率较高，肿瘤转移到骨上，会出现伴随着骨质溶解性的骨破坏，其症状为骨痛、病理性骨折、脊椎压迫和高钙血症。超过70%的骨转移癌患者会出现剧烈而持续性骨痛，严重影响患者的生活质量［1］。

177Lu是一种很有潜力的放射性治疗用核素。177Lu具有适宜的物理半衰期（6.7d），发射的β－粒子在组织中的平均射程小于200μm，适合杀死癌细胞。177Lu发射的γ射线可用于单光子发射计算机断层成像术（Single－Photon Emission Computed Tomography，SPECT）显像，以监测和指导治疗过程。177Lu较长的半衰期为其生产、产品的质量分析和质量控制以及对远离核素生产地点的供应提供了方便；也可减少多次注射给病人带来的痛苦。177Lu可以通过反应堆辐照产生，具有低成本和易得性，因此适用于制备放射性药物［2］。在治疗骨转移癌疼痛的应用中，177Lu 标记的膦酸盐类化合物成为研究热点［3－6］。

1，4，7，10－四氮杂环十二烷－1，4，7，10－四甲撑膦酸（1，4，7，10－tetraazacyclododecane－1，4，7，10－Tetraaminomethylenephosphonate，DOTMP）是1，4，7，10－四氮杂环十二烷（1，4，7，10－tetraazacyclododecane，cyclen）的一种衍生物，是一种多齿氨基亚甲基膦酸类配体，可与多种核素形成稳定配合物。近几年，国外已经研究了应用不同放射性核素标记的DOTMP治疗骨转移癌引起的疼痛，并且取得了一些进展［7－10］。本研究拟以1，4，7，10－四氮杂环十二烷为主要原料合成DOTMP，对其进行177Lu 标记，并对177Lu－DOTMP在骨转移癌模型鼠中的分布和在健康大白兔体内的显像进行研究，考察其对骨的靶向性。

1 主要实验材料

1.1 实验试剂和实验动物

1，4，7，10－四氮杂环十二烷：美国Sigma公司产品；天然三氧化二镥（Lu2O3）：美国Alfa Aesar产品；37%甲醛溶液（HCHO）、无水亚磷酸（H3PO3）、浓盐酸（HCl）等试剂均为分析纯，购于国药集团北京化学试剂公司。

177LuCl3溶液：参考文献［7］由反应堆制备177Lu，用1.0mL 0.2mol／L 盐酸溶液溶解所得177Lu得到177LuCl3溶液，活度为919GBq。

小鼠S180肉瘤细胞：中国医学科学院肿瘤医院提供。

昆明小鼠：雄性，4～5 周龄，体重18～20g，25只，北京华阜康生物科技股份有限公司提供；日本大耳白兔：雄性，体重2.6kg，1只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要仪器

RE－52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF－2磁力加热搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；AR2130电子天平：梅特勒－托利多仪器上海有限公司；XZ－2 真空油泵：上海真空泵厂；DZX－3真空干燥箱：上海福马实验设备有限公司；RM－905a放射性活度计：中国计量科学研究院；Wizard 1470 全自动γ 计数仪：美国Perkin Elmer公司产品；AR－2000放射性薄层扫描仪：美国Bioscan 公司；Mili－Q 超纯水系统：美国Millipore公司；Whatman 滤纸（3 mm）：英国Whatman公司；e.cam duet SPECT 显像仪：德国Siemens公司。

2 实验方法

2.1 DOTMP的合成和标记

按照文献［12］方法确定合成方案，其合成路线示于图1。以0.5g 1，4，7，10－四氮杂环十二烷为原料，在盐酸维持强酸性条件下加入亚磷酸和37%甲醛溶液，回流2h，得到粗产物，以丙酮重结晶。

图1 DOTMP 的合成路线

DOTMP合成和鉴定后，依据文献［13］的标记条件对DOTMP 进行放射性177Lu 标记。采用放射性色层扫描仪测定标记率。

2.2 177 Lu－DOTMP 在荷瘤小鼠体内的生物分布

2.2.1 小鼠骨转移癌动物模型的建立

在体外培养细胞株小鼠S180瘤细胞后，用PBS悬浮至3×107／mL，以昆明小鼠为宿主，进行腹水传代。每只小鼠腹腔注射100μL 瘤细胞，饲养9d后进行传代培养，三代后可用于皮下肌肉接种实验。抽取荷S180瘤小鼠腹水，对瘤细胞进行台盼兰染色后计活细胞数，用生理盐水稀释至107／mL。每只小鼠右后肢股骨旁沿骨膜接种100μL 约106个癌细胞。在SPF 级动物房中常规饲养，观察肿瘤生长情况，约10d后肿瘤细胞侵蚀入骨，断颈处死动物，分别取左右双侧腿骨，进行双侧骨组织病理对比分析。

另取25只昆明小鼠，依照上述方法制作荷瘤小鼠，饲养于SPF级动物房，观察肿瘤生长情况，待肿瘤长至约0.8cm3用于生物分布实验。

2.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内分布

取25只荷瘤昆明种小鼠，随机分成5组，每组5只。经尾静脉注射177Lu－DOTMP 溶 液100μL（约0.22 MBq），分别于注射后1、3、24、48h和6d 处死动物，取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、肿瘤、头盖骨和双侧胫骨，称重并测量其γ计数，计算出单位质量脏器摄取放射性活度占注入总活度的百分率（%ID／g）。

2.3 177Lu－DOTMP在健康兔体内的显像

取1只健康日本大耳白兔，经耳缘静脉注射1.0 mL177Lu－DOTMP（约150 MBq），分别于22h和46h显像，并对比显像效果。约于显像前10min，再经耳缘静脉注射1.5mL 5%巴比妥钠溶液麻醉动物。选择能窗113keV 进行显像，显像数据在计算机系统256×256 矩阵中进行记录与分析。每次采集计数为500 000。

3 结果与讨论

3.1 DOTMP的合成与分析鉴定

以1，4，7，10－四氮杂环十二烷，亚磷酸和甲醛等为原料，按照文献［8］的方法合成DOTMP，并经过重结晶得到产物，产率为63%。合成的DOTMP 的红外光谱中有4 个典型吸收峰：3 138、2 855、1 683、1 455、1 288cm－1。3 138cm－1为羟基伸缩振动峰，2 855cm－1是亚甲基对伸缩振动峰，1 683cm－1为P－O 伸缩振动峰，1 455cm－1是C—P单键的伸缩振动，1300～900cm－1区域 是C—N 键的伸缩振动，P＝O 等双键的伸缩振动吸收。

DOTMP的1H－NMR 数据（D2O，δ）：3.16～3.20（—N—CH2—PO3H2），3.20～3.50（—N—CH2—CH2—N）。

DOTMP的质谱ESI－MS数据（M—1）相对分子质量为547.2，DOTMP的理论相对分子质量为548.1，说明所合成的产物为目标产物。

本研究采用的合成方法是目前报道中常用的合成方法，以1，4，7，10－四氮环十二烷为母核在四个相同位置引入膦酸亚甲基，所得产率也与文献报道相似。

在选定的实验条件下，177Lu－DOTMP 的标记率为99.4%。经生理盐水稀释后，用于生物分布实验或日本大耳白兔显像研究。

3.2 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内生物分布

3.2.1 动物模型的建立

模型小鼠双侧股骨组织病理切片于光学显微镜下观察，结果示于图2。

图2 模型小鼠双侧股骨组织病理

比较图2左右两张图片可以看出，在接种小鼠S180瘤细胞侧的肿瘤细胞生长、浸润成股骨旁肉瘤，瘤细胞已侵及干骺端骨膜组织，肿瘤的主体位于股骨肌肉组织内，但已导致骨组织损伤。病理检测的结果显示，模型小鼠符合实验要求。

3.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内生物分布

177Lu－DOTMP在昆明小鼠体内的生物分布列于表1。表1 结果显示，177Lu－DOTMP 在血中清除快，在注射1h后为（0.31±0.05）%ID／g，在3h至6d都保持在很低的水平；177Lu－DOTMP在骨中有明显的放射性摄取，注射1h后已经达到最高值，头骨和股骨的放射性摄取分别为（18.00±4.68）和（16.67±5.11）%ID／g；注射48h 后，除骨骼外，血和其它主要脏器中都无明显放射性富集；6d后骨中尚存较高放射性摄取。与正常小鼠体内呈现出相似的代谢趋势。177Lu－DOTMP在肾中比在其它脏器中摄取高，提示177Lu－DOTMP 主要通过肾脏排泄。荷瘤侧的股骨放射性摄取略高于非瘤侧股骨，可能与膦酸盐在体内的吸收途径相关。177Lu－DOTMP在肿瘤组织中摄取很低，是由于在本研究中肿瘤组织不是靶向器官。DOTMP 能够定位于骨，是传递足够的放射性剂量进行放射性治疗，减轻骨转移骨痛的基础。

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内分布（±s，n＝5）

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠体内分布（±s，n＝5）

3.3 177Lu－DOTMP在健康兔体内的显像

注射177Lu－DOTMP 22h和46h后，正常日本大耳白兔的SPECT 显像结果示于图3。由图3可以看出：注药后22h，膀胱有明显的放射性浓集，说明其主要经泌尿系统排泄；在其他主要器官及软组织中均未见明显浓集，说明其在体内的清除速度较快；在骨骼尤其是关节处的摄取高，可以看到全身骨骼轮廓，除膀胱外身体其它组织及器官中都已看不到放射性摄取，体现出177Lu－DOTMP作为骨痛治疗药物良好的体内分布及药代动力学性质。

图3 日本大耳白兔177Lu－DOTMP SPECT显像

4 结论

1）本研究以1，4，7，10－四氮环十二烷为原料合成并纯化得到产物DOTMP，产率约为63%。

在选定的实验条件下，用177Lu标记DOTMP形成的配合物177Lu－DOTMP，标记率＞99.0%。

2）荷瘤鼠体内生物分布结果显示，177Lu－DOTMP可以选择性地在骨组织吸收，具有良好的靶向性，而且在血中清除较快，在其他脏器只有少量摄取。

3）正常兔显像结果显示，177Lu－DOTMP 在骨中摄取高且滞留时间长。

以上结果提示，177Lu－DOTMP 作为潜在的骨转移癌疼痛治疗药物，值得进一步研究。

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