他克莫司对多发性硬化大鼠髓鞘碱性蛋白的动态变化及影响

赵丽波 张健莉 付宏娟 黄月萍

黑龙江省医院老年神经内科，黑龙江哈尔滨 150036

他克莫司对多发性硬化大鼠髓鞘碱性蛋白的动态变化及影响

赵丽波 张健莉 付宏娟 黄月萍

黑龙江省医院老年神经内科，黑龙江哈尔滨 150036

目的 探讨他克莫司（FK506）对多发性硬化（MS）大鼠髓鞘碱性蛋白检测的动态变化及影响。 方法 将试验动物随机分为两组，对照组（10只）予以实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）+生理盐水组；研究组（12只）在EAE诱导的第1～7天，每日腹腔内注射剂量为1mg/kg的FK506，其中急性发作期8只，缓解期4只。检测研究组和对照组周围血和脑脊液髓鞘碱性蛋白（MBP）的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后不同时间MBP的变化情况。结果 研究组血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组（P＜0.05）。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平（P＜0.05）。研究组大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组（P＜0.01），且大鼠急性发作期MBP水平血清及脑脊液中均分别显著高于MS缓解期（P＜0.01）。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关（r=0.562，P＜0.01）。12只大鼠予以他克莫司腹腔注射后，治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP水平均较治疗前明显降低，且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显（P＜0.01）。 结论 通过检测周围血和MBP的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP的变化情况，一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义，另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据。

多发性硬化；髓鞘碱性蛋白；血液；脑脊液；大鼠

多发性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病，MS产生的免疫反应多认为是自身免疫细胞被激活后对髓鞘碱性蛋白（MBP）的免疫反应[1]。MBP是构成中枢神经系统髓鞘的一种特殊蛋白质，在髓鞘形成和脑分化发育过程中起着重要作用[2]。MS患者体内中枢神经系统的自身抗原-MBP暴露与免疫活性细胞相互作用诱导了特异的免疫应答，导致炎性髓鞘病理性脱失，游离的MBP就会进入血液中导致血液中含量升高[3]。目前临床对MS进行脑脊液免疫学检查项目较多，但尚无一满意的特异性检查，因此，临床一般将周围血和脑脊液同时进行检查[4]。他克莫司（FK506）是一种免疫抑制剂，除了在抑制器官移植排斥反应方面具有显著疗效外，还广泛应用于斑秃、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗，在对脊髓损伤的模型中具有保护神经，营养神经和促进神经再生和抑制T细胞增生、活化的作用。本研究旨在通过观察利用髓鞘碱性蛋白作为抗原，复制MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）豚鼠周围血和脑脊液MBP的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后不同时间MBP的变化情况，从而可能为预防MS的临床复发提供一种有效的新药提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周龄，体重 200 g左右，利用髓鞘碱性蛋白作为抗原，复制MS的动物模型EAE，在每只大鼠的双侧后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25μg的弗氏完全佐剂（FCA）200μL，模型制备成功的表现为急性、严重的单向病程，可自发缓解。将试验动物随机分为两组，对照组予以EAE+生理盐水，共10只，研究组在EAE诱导的第1～7天，每日腹腔内注射剂量为1mg/kg的FK506，共12只，其中急性发作期8只，缓解期4只。

1.2 统计学方法

数据采用SPSS 13.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验或进行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠及对照组血清和脑脊液中MBP水平比较

研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

表1 两组大鼠血清和脑脊液中MBP水平比较（，ng/m L）

表1 两组大鼠血清和脑脊液中MBP水平比较（，ng/m L）

注：与同组血清MBP比较，#P＜0.05

组别 只数 MBP水平血清 脑脊液研究组对照组12 10 t值 P值7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性发作期及缓解期MBP在血清及脑脊液中的变化情况比较

研究组MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01），且MS急性发作期MBP水平血清及脑脊液中均分别显著高于MS缓解期，差异有高度统计学意义（P＜0.01），且MS大鼠其脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关 （r=0.562，P ＜ 0.01）。 见表 2。

2.3 研究组大鼠血清和脑脊液治疗前后不同时间MBP水平的变化情况比较

12只大鼠予以他克莫司注射后，结果显示，治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP水平均较治疗前明显降低（P＜0.01），且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

3 讨论

MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其病因及病理学机制至今仍未完全阐明，但MS自身免疫的发病机制已得到证实和公认[5]。各种原因导致髓鞘破坏后，血清或脑脊液中的MBP浓度增高，因此测定血清和脑脊液MBP的水平，可以用于反映中枢神经系统有无实质性损害及有无髓鞘脱失[6]。由于MS患者的免疫功能异常，使MBP具有抗原性，引起T淋巴细胞致敏活化，而致敏的T淋巴细胞反应对髓鞘有很大的破坏作用[7]。

表2 大鼠急性发作期及缓解期MBP在血清及脑脊液中的变化情况比较（，ng/m L）

表2 大鼠急性发作期及缓解期MBP在血清及脑脊液中的变化情况比较（，ng/m L）

注：与缓解期比较，*P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.01

组别 只数 MBP水平血清 脑脊液急性发作期缓解期对照组F值P值8 4 1 0 10.86±1.59*△5.35±1.14△1.52±0.83 5.342＜0.01 17.45±2.82*△8.23±1.44△4.39±1.35 7.231＜0.01

表3 研究组大鼠血清和脑脊液治疗前及治疗后的不同时间MBP 的变化情况比较（，ng/m L，n=32）

表3 研究组大鼠血清和脑脊液治疗前及治疗后的不同时间MBP 的变化情况比较（，ng/m L，n=32）

指标 治疗前 治疗后第3天治疗后第7天 F值 P值血清MBP水平脑脊液MBP水平t值P值8.29±1.31 12.07±3.42 3.389＜0.01 7.62±1.74 5.84±1.85 3.971＜0.01 3.89±0.42 1.67±0.23 0.428＜0.01 8.253 9.527＜0.01＜0.01

本组资料显示，研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组（P＜0.05），提示检测MBP含量变化是诊断MS的一项有价值的生化指标，本组表2结果显示，研究组急性发作期及缓解期大鼠血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组（P＜0.01），说明大鼠活动期血清MBP明显升高，反映了损害的范围和严重程度，尤其对判断MS是否处于活动期具有重要的临床意义[8]。

本组表1、2均显示，研究组12只大鼠，其中急性发作期8只MS其脑脊液中MBP水平最高。Majewska等[9-10]研究证实，MS患者急性期脑脊液MBP与临床评分关系密切，提出监测脑脊液MBP的变化水平，有利于判断MS的病情严重程度和预后。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关（r=0.562，P＜0.01），说明作为主要自身抗原之一的MBP对MS的发病敏感性高，检测患者CSF和血清中的MBP水平对于MS的诊断和疗效监测有重要参考价值。

FK506是一种新型免疫抑制剂，是一种广泛应用于器官移植的大环内酯类免疫抑制药物，于1984年从日本筑波山土壤中被分离到。研究组12只大鼠应用他克莫司治疗后，MBP水平在治疗前明显增加，但治疗后的第3天及治疗后的第7天的不同时间显著下降，说明MS对他克莫司等激索类药物的短程疗效较好。国内外已有学者将FK506应用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究证实，FK506通过免疫抑制和神经保护作用显著改善小鼠的髓鞘脱失和轴突损伤。

综上所述，通过检测周围血和脑脊液髓鞘碱性蛋白的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP的变化情况，一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义，另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据，但由于样本量过小，仍需日后在扩大样本量的基础上对其进一步深入研究。

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Influence of FK 506 on dynam ic change of m yelin basic protein in rats with multiple sclerosis

ZHAO Libo ZHANG Jianli FU Hongjuan HUANG Yueping
Department of Old Age Neurology,Heilongjiang Province Hospital,Heilongjiang Province,Harbin 150036,China

Objective To explore the impact of the dynamic changes of tacrolimus formultiple sclerosis ratmyelin basic protein detection.MethodsExperimental animalswere randomly divided into two groups,the control group were given the EAE+saline group,a total 10,study group in EAE induced daily intraperitoneal injection dose for 1mg/kg FK506 from 1 to 7 days,a total of 12 acute exacerbation of 8 rats,4 rats in remission.We examined the level of the blood and cerebrospinal fluidmyelin basic protein(MBP)and dynamic observation for12 casesMSrats(study group)and 10 normalhealthy subjects(control group).ResultsMBP(research group)in serum and cerebrospinal fluid were significantly higher than that of the normal control group(P<0.05).And MBP in the cerebrospinal fluid of two groupswere significantly higher than the serum MBP level(P<0.05).The serum and CSFMBP level of acute exacerbation and remission period of MS rats in the research group were significantly higher than that in the control group (P<0.01),and MBP in serum and cerebrospinal fluid of acute exacerbation MSwere respectively significantly higher than MS rats in remission (P<0.01).In addition to the conventional basis for symptomatic 12 MS rates after admission tacrolimus treatment,after treatment 3 days and 7days,MBP level in the serum and CSF was significantly lower than before treatment,compared with serum，MBP levels in the cerebrospinal significantly decreased (P<0.01).ConclusionDynamic observation MBP the change by detecting the level of peripheral blood and MBP and the application of tacrolimus the secretary before treatmentand after treatment on the one hand,to judge MSprognosis,the severity of the disease and the clinical diagnosis has importantthe clinical significance,on the other hand,itmay be an effective new drug for the prevention ofmultiple sclerosis clinical recurrence provide the basis for guiding.

Multiple sclerosis;Myelin basic protein;Blood;Cerebrospinal fluid;Rats

R744.5

A

1673-7210（2012）12（a）-0016-03

黑龙江省科技计划项目（课题编号：GC12C305-1）。

2012-09-17 本文编辑：冯 婕）