组织因子、组织因子途径抑制物对脓毒症凝血异常的影响

郑少玲 郭振辉 孙 杰 姜 巧 陈 蕊

1.广州医学院，广东广州 510182；2.广州军区广州总医院MICU，广东广州 510010

组织因子、组织因子途径抑制物对脓毒症凝血异常的影响

郑少玲1郭振辉2孙 杰2姜 巧2陈 蕊2

1.广州医学院，广东广州 510182；2.广州军区广州总医院MICU，广东广州 510010

目的 探讨脓毒症时组织因子（tissue factor，TF）与组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的表达及其平衡对凝血异常的影响。 方法 昆明小鼠72只采用盲肠结扎穿孔模型 （cecal ligation and puncture，CLP），分为正常组、假手术组和造模组，每组根据不同时间点（2、4、8、12 h）分4个亚组，每个亚组各6只，检测血小板计数和凝血指标，采用ELISA法检测血浆TF和TFPI浓度。 结果 盲肠结扎穿孔后，造模12 h组PT、TT、APTT和DD显著升高，Fbg和PLT计数显著降低，与正常组及假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。造模2 h组TF与TFPI均显著升高，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；且TF浓度随时间呈进行性升高，而TFPI未见进一步升高。结论 脓毒症时，血小板减少及TF、TFPI表达增加的失衡可能是诱发凝血异常进而参与MODS发生的关键因素。

脓毒症；凝血异常；血小板减少；组织因子；组织因子途径抑制物

脓毒症常常伴有凝血功能异常，内皮细胞的激活和功能紊乱在其中起了关键作用，内皮组织一方面通过组织因子（tissue factor，TF）的表达 、凝血 因子 （von Willebrand factor，vWF）和血小板之间的相互作用达到促凝血效应，另一方面，通过抑制抗凝剂组织因子途径抑制剂 （tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的反应、抗凝血酶和活化蛋白C系统，抑制纤维蛋白原溶解[1-2]。过激的炎症反应导致大量微血管血栓形成和器官功能衰竭（MODS），成为弥散性血管内凝血（DIC）的病理生理过程[3-4]。TFPI是TF的重要生理抑制物，存在于微血管内皮细胞里，拮抗TF的凝血启动，在抑制血栓形成和血管重塑等方面发挥重要作用，还与炎症、动脉粥样硬化 （AS）、肿瘤、败血症等疾病相关[5]。TF与TFPI的平衡影响着DIC和MODS的发生，而游离的TF、TFPI在一定程度上反映其表达水平。为此，本实验拟采用经典脓毒症模型——盲肠结扎穿孔（CLP），复制小鼠脓毒症模型，观察血小板计数、凝血指标和游离TF、TFPI水平的变化，探讨脓毒症时TF与TFPI的表达，及其平衡对凝血异常的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：高速低温离心机（Sigma），酶标仪（Anto），ZK-82A电热真空干燥箱（上海实验仪器总厂），血细胞分析仪（sysmex XT-1800I），凝血分析仪（STA compact CT）。试剂：Mouse TF 96 test ELISA Kit （美国 R&D公司），Mouse TFPI 96 test ELISA Kit（美国R&D公司）。

1.2 动物分组及造模

健康雌性昆明小鼠72只，购自广东省医学实验动物中心，体重（22±4）g，适应性喂养 1 周，术前禁食禁水 12 h，随机分为正常组、假手术组、造模组，每组各24只；各组按术后时间点又分为2、4、8、12 h四个亚组，每亚组各6只。正常组不做任何处理。造模组采用经典CLP模型：用10%水合氯醛（0.03mL/10 g）经腹腔注射麻醉小鼠，沿腹正中线作1 cm切口，找到盲肠，结扎盲肠根部，用大号针头在盲肠远端刺一孔，挤出少量肠内容物，还纳腹腔，逐层缝合腹壁。假手术组开腹找到盲肠后，随即关腹。造模组和假手术组给予注射生理盐水（约 0.2mL/6 h）。

1.3 实验方法

1.3.1 TF、TFPI浓度测定 采用ELISA法。各组按时间点经眼眶采血，收集血液标本至无菌无致热源1.5 mL EP管中，4℃静置过夜，将血样高速离心2 000 g 15min后取上清，分装后-70℃保存。实验前，室温下溶解标本，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，绘制标准曲线，计算样本TF、TFPI浓度。

1.3.2 血小板与凝血四项检查 取各组术后12 h亚组的血样0.5mL置于0.109mol/L枸橼酸钠抗凝试管中，检测血小板计数（PLT）。同法取血样0.5mL高速离心2 000 g 10min，取上清液，以磁珠法进行凝血四项分析，检测凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血酶时间（APTT），纤维蛋白原（Fbg），以酶联免疫荧光定量法测定D-二聚体（DD）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组术后12 h亚组的凝血指标比较

与正常组和假手术组相比，造模组术后12 h凝血指标中的PT、TT、APTT和DD显著升高；而Fbg和PLT计数显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组术后不同时间TF浓度比较

绘制TF浓度标准曲线：Y=114.5X-2.936（R2=0.994）。造模组各时间TF浓度均显著高于正常组和假手术组，且随着时间的增加呈现显著的上升趋势；与正常组相比，假手术组TF浓度也显著升高；各组间比较差异有统计学意义 （P<0.05）。 见表 2。

2.3 各组术后不同时间TFPI浓度比较

对标准品进行梯度稀释得出TFPI标准曲线为Y=9.73X-0.014（R2=0.994），样品以 1∶3 稀释，故样本 TFPI的实际浓度为测得数据的4倍。与正常组及假手术组相比，造模组各时间点TFPI浓度均明显上升，假手术组与正常组相比TFPI浓度亦显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），但术后4 h之后造模组TFPI浓度并没有随时间的延长而呈现上升趋势。见表3。

3 讨论

各种原因导致的腹膜炎是脓毒症常见病因之一，CLP模型有效地模拟了腹腔空腔脏器穿孔与感染，并产生脓毒症甚至MODS，而凝血功能相关指标的异常与脓毒症进展程度显著相关[6]。本实验结果显示，造模组术后12 h的PLT和Fbg均明显下降，同时，PT、TT、APTT 和 DD 升高（P<0.05）。说明脓毒症发生的早期，凝血因子大量消耗，同时，被激活的纤溶激酶降解，凝血亢进与纤溶失衡是脓毒症发生发展至DIC的主要病理生理过程。在炎症刺激后，血小板被激活，在血小板表面大量促凝物质表达，膜表面为各种凝血蛋白酶级联反应的成分提供了凝集的必要条件，特别是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），是重要的凝血级联反应的细胞催化剂。血小板的凋亡与消耗增加，导致血小板减少。在脓毒症过程中，血小板减少症频繁发生，成为脓毒症患者死亡的独立危险因素，血小板也成为重要的标志物[7-8]。

表1 各组术后12 h亚组的血小板、凝血四项和D-二聚体比较（，n=6）

表1 各组术后12 h亚组的血小板、凝血四项和D-二聚体比较（，n=6）

注：与正常组比较，★P<0.05；与假手术组比较，☆P<0.05

组别 PLT（×109/L） PT（s） TT（s） APTT（s） Fbg（g/L） DD（mg/L）正常组假手术组造模组181.33±35.10 172.83±24.23 122.33±55.50★☆11.67±2.16 12.33±1.63 17.00±2.28★☆15.17±2.64 16.33±2.16 19.00±2.61★☆27.50±4.04 27.67±1.97 38.50±4.51★☆3.07±0.64 3.57±0.61 1.85±0.30★☆0.42±0.26 0.55±0.27 1.90±0.45★☆

表2 各组术后不同时间小鼠血标本TF浓度比较（，n=6，pg/m L）

表2 各组术后不同时间小鼠血标本TF浓度比较（，n=6，pg/m L）

注：与正常组比较，★P<0.05；与假手术组比较，☆P<0.05

组别 2 h 4 h 8 h 12 h正常组假手术组造模组42.44±2.19 54.12±3.47★59.81±3.69★☆42.29±1.98 53.70±4.14★82.77±9.11★☆41.45±1.32 56.33±2.68★125.34±6.32★☆42.75±1.25 60.73±1.43★139.81±6.17★☆

表3 各组术后不同时间小鼠血标本TFPI浓度比较（，n=6，ng/m L）

表3 各组术后不同时间小鼠血标本TFPI浓度比较（，n=6，ng/m L）

注：与正常组比较，★P<0.05；与假手术组比较，☆P<0.05

组别 2 h 4 h 8 h 12 h正常组假手术组造模组14.60±0.76 16.67±2.19★26.20±2.21★☆15.11±0.37 18.94±0.39★28.08±2.46★☆15.72±0.92 18.01±2.92★27.45±2.52★☆15.00±0.42 19.1±0.96★29.2±1.41★☆

脓毒症时凝血异常与炎症反应之间相互影响，形成恶性循环，在连结凝血和炎症过程中，TF最为关键，是启动外源性凝血途径的关键凝血因子[9]。本实验测得游离TF水平，造模组各时间点均高于正常组、假手术组，并随时间延长而升高。TF通常不存在与脉管系统，但在炎症状态下，通过炎症因子的激活，诱导了单核细胞和巨噬细胞表达TF，并启动凝血过程[10-11]。目前认为，循环中的TF已经被看作血细胞的成份之一，尤其是血细胞微粒相关的TF，以可溶解的形式在血液中流通，并完成促凝血活动，进一步扩大了循环TF的概念。内皮细胞在促炎细胞因子的刺激下释放TF，循环TF的血浆浓度可作为炎症诱导凝血激活的临床标志物之一[4]。

在生理条件下，抗凝系统是持续活动的，以防止血液在内皮细胞表面形成凝块。在维护这个抗凝环境中，内皮组织起了关键作用，通过3个主要的抗凝蛋白来控制血凝块：TFPI、AT和APC[12]。TFPI是目前所知的唯一能抑制Ⅶa/TF复合物活性的生理性抗凝物质，其能够抑制构建在磷脂小体上的Ⅶa/TF复合物的活性。TFPI表达影响凝血功能及其病理状态下的DIC发生[13]。TF一旦启动凝血途径，血管内皮细胞（VEC）上的TFPI将迅速改变构型，与TF介导的凝血因子复合物结合形成失活的FⅩa-TFPI-FVⅡa-TF而发挥其抗凝功能[14]。游离的TFPI可能反映VEC的持续损伤，导致锚着于其上的高活性TFPI脱落。因此，同时检测游离的TF和TFPI水平，既可反映各自表达的动态变化，也能反映凝血功能的异常[15]。本实验结果显示：造模组术后2 h，TF浓度和TFPI浓度显著升高，其后，TF的表达呈进行性上升，而TFPI并没有进一步升高。说明脓毒症早期各种效应细胞表达并产生了大量的游离TF，启动并激活凝血系统，而后TF与TFPI的不同步升高，表明了脓毒症时存在凝血激活持续亢进状态，而抗凝的物质在质和量上出现了相对的不足。TFPI是正常附属于内皮渠道的蛋白聚糖 （PGs），PGs是黏多糖GAGs绑定的一个核心蛋白，在脓毒症中，促炎细胞因子减少在内皮表面的GAGs合成体，可以因此影响TFPI的功能，这也影响了凝血激活和抗凝过程的平衡，导致了凝血的激活与亢进[16]。

综上所述，脓毒症时存在血小板减少和凝血异常，在凝血激活与亢进的同时，TF、TFPI表达出现不同步增加。由此推测，TF、TFPI表达增加的失衡可能是诱发凝血异常进而参与MODS发生的关键因素。

[1]Van DP.Tissue factor as an initiator of coagulation and inflammation in the lung[J].Crit Care，2008，12，6：3.

[2]Semeraro N.Sepsis-associated disseminated intravascular coagulation and thromboembolic disease [J].Mediterr JHematol Infect Dis，2010，2（3）：2010-2024.

[3]Egorina EM，Sovershaev MA，Hansen JB.The role of tissue factor in systemic inflammatory response syndrome [J].Blood Coagul Fibrinolysis，2011，22（6）：451-456.

[4]Schouten M，Wiersinga WJ，Levi M，et al.Inflammation， endothelium，and coagulation in sepsis[J].JLeukoc Biol，2008，83：536-545.

[5]Delgiudice LA，White GA.The role of tissue factor and tissue factor pathway inhibit or in health and disease states [J].J Vet Emerg Crit Care：San Antonio，2009，19（1）：23-29.

[6]Bajaj MS.Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor[J].Thromb Haemost，2001，86（4）：959-972.

[7] Croce K，Libby P.Intertwining of thromhosis and inflammation in atherosclerosis[J].Curr Opin Hematol，2007，4（1）：55-61.

[8]祝伟，吕青，陈华文，等.血必净注射液对脓毒症大鼠肠TLR4和NF-κB 的影响[J].中国医药导刊，2010，12（8）：293-294.

[9]Wang L，Bastarache JA，Ware LB.The coagulation cascade in sepsis[J].Curr Pharm Des，2008，14（19）：1860-1869.

[10]Akca S，Haji-Michael P，Mendonca D，et al.Time course of platelet counts in critically ill patients[J].Crit Care Med，2002，30：753-756.

[11]石献斌，田小平，石伟，等.冠心病患者血浆组织因子及组织因子途径抑制物变化分析[J].中国医药导刊，2011，13（2）：1332-1333.

[12]LeviM，Van DP.Two-way interactions between in?ammation and coagulation[J].Trends Cardiovasc Med，2005，15：254-259.

[13]Mosad E，Elsayh KI，Eltayeb AA.Tissue factor pathway inhibitor and P-selectin asmarkers of sepsis-induced non-overt disseminated intravascular coagulopathy[J].Clin Appl Thromb Hemost，2011，17（1）：80-87.

[14]徐兆军，别华容，田敏，等.组织因子及组织因子途径抑制物在急性脑血管意外并发神经源性肺水肿中的变化研究[J].中国医药导报，2011，8（32）：39-40.

[15]Yasuda T.Plasma tissue factor pathway inhibitor levels in patientswith acute pancreatitis[J].JGastroenterol，2009，44（10）：1071-1079.

[16]Iversen N，Lindahl AK，Abildgaard U.Elevated plasma levels of the factor Xa-TFPI complex in cancer patients [J].Thromb Res，2002，105：33-36.

Effects of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor on sepsis-induced abnormal coagulation

ZHENG Shaoling GUO Zhenhui SUN Jie JIANGQiao CHEN Rui
1.Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou 510182,China;2.Department of MICU,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangdong Province,Guangzhou 510010,China

Objective To investigate the effects of tissue factor(TF)and tissue factor pathway inhibitor(TFPI)expression and balance on abnormal coagulation in sepsis.Methods72 KM mice were performed cecal ligation and puncture(CLP),and divided into the normal group,sham-operated group and model group.According to the different time points(2,4,8,12 h),the three group were divided into 4 subgroups respectively,each group had 6mice.The level of platelet and coagulationmarkerswere observed,and the blood concentration of TF and TFPIwas detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with normal group and sham-operated group,the concentration of PT,TT,APTT and DD increased significantly,while Fbg and PLT decreased in themodel group at 12 h after CLP (P<0.05).The concentration of TF and TFPI increased significantly in themodel group at 2 h after CLP,each group had significant differences(P<0.05).With time extension,the concentration of TF continually increased,but the concentration of TFPI showed inversely.ConclusionIn sepsis,thrombocytopenia and imbalance of TF and TFPI expression may be key factors induced abnormal coagulation and MODS.

Sepsis;Abnormal coagulation;Thrombocytopenia;Tissue factor;Tissue factor pathway inhibitor

R656

A

1673-7210（2012）12（a）-0013-0312222

解放军总后勤部十二五重点专项计划（项目编号：卫保健2010119号-10djz09）。

郑少玲（1981.11-），女，主治医师，2007级广州医学院急诊医学专业在读硕士；研究方向：重症脓毒症凝血功能障碍的临床研究。

郭振辉，男，博士研究生，硕士生导师，主任医师；研究方向：重症脓毒症凝血功能障碍的临床研究。

2012-09-24 本文编辑：程 铭）