不同试验条件下猪肉中气单胞菌生长预测模型的建立和验证

董庆利，高 翠，丁 甜，余华星

(1 上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093;2 韩国国立江原大学食品科学与生物技术学科，韩国春川 200701)

气单胞菌Aeromonas spp.属于革兰阴性兼性厌氧短杆菌，在近几年的研究中被证实是一种人畜共患病的病原菌，有关该菌为胃肠炎和败血症的一种重要致病菌的报道日益增多［1－3］，同时该菌也是冷却猪肉中的优势腐败菌之一［4］.冷却肉是指在卫生标准条件下，按照国家屠宰规范对畜禽进行屠宰后24 h内将肉冷却，使得肉的中心温度降至0～4℃，并在随后的排酸、分割、剔骨、包装、运输以及销售过程中，肉温始终保持在0～4℃［5］.冷却猪肉的优势腐败菌有假单胞菌Pseudomonas spp.、气单胞菌、肠杆菌属Enterobacteriaceae等［6］.在国内外对冷却猪肉中微生物进行的相关研究中多是针对大肠埃希菌Escherichia coli、假单胞菌等病原菌，而针对气单胞菌的相关研究较少.在对气单胞菌的研究过程中发现除温度外，pH和初始接种量对气单胞菌的生长也有显著影响，所以设计试验研究这3种环境因子对冷却猪肉中气单胞菌生长的影响，以便更好地监测其生长，降低病原菌污染食品的风险.本研究将气单胞菌直接接种到猪肉中，在不同的环境下进行培养，观测环境对其生长的影响规律，用一级和二级微生物模型对数据进行拟合，并通过数学检验和随机条件模拟，使得到的模型更接近于冷却猪肉中气单胞菌实际的生长规律.

1 材料与方法

1.1 试验设计

应用 Design－Expert v.7.1.6 软件(美国 Stat－Ease公司)，参照预试验结果，对响应曲面的水平值进行中心组合设计(Central Composite Design，CCD)，如表1所示.

表1 中心组合设计的因素和水平1)Tab.1 Factors and levels from central composite design

1.2 材料

五丰上食优质精腿肉购于上海卜蜂莲花超市，迅速置于0～4℃冰箱中冷藏备用.

1.3 菌种的选用及活化

气单胞菌(No.23564)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，于气单胞菌液体培养基(蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，胰蛋白胨10 g，L－盐酸鸟苷酸 5 g，甘露醇 1 g，肌醇 10 g，Na2S2O3·5H2O 0.4 g，枸橼酸铁胺0.5 g，溴甲酚紫0.02 g，琼脂3 g，溶于1000 mL蒸馏水)中，27℃下活化3次，进而挑取良好的单菌落制得初始菌悬液.培养基的配制参照文献［7］.

1.4 样品接种和贮藏

按试验设计中的20组处理，用5 mol·L－1的HCl和5 mol·L－1的 NaOH 将生理盐水(8.3 mg·L－1的NaCl溶液)调到所需pH，121℃灭菌15 min，配制无菌水.称取25 g肉块，悬浮于80℃无菌水中10 s进行消毒.将1.3中制得的初始菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释，并根据预实验中比浊法标准曲线方程调整至设计中所需初始接种量，然后将灭菌后肉块悬浮于其中15 s进行接种.在无菌袋中注入20 mL相应pH的无菌水，将接种后肉块封装于上述无菌袋中，按试验设计分别置于相应温度下恒温培养.

1.5 微生物计数

适时取上述肉样，用灭菌剪刀将肉样剪碎置于装有205 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，然后将无菌袋中的液体和残留菌冲至三角瓶中，充分摇匀，按10倍稀释法稀释到所需稀释度，参照文献［8］用平板计数法进行气单胞菌计数.直至细菌生长达到稳定期.其中培养基参照Mccoy等［9］设计的气单胞菌鉴别培养基.

1.6 生长曲线的拟合和生长参数的观测

应用Origin 8.0软件(美国OriginLab公司)，用修正的Gompertz模型［10］对冷却猪肉中气单胞菌的生长曲线进行拟合，计算气单胞菌生长的最大比生长速率(U/h－1)和迟滞期(LPD/h).具体如下:

1.7 二级生长预测方程(RSM)的建立

应用Design－Expert v.7.1.6软件建立变量的不同水平与生长参数之间的多元回归方程，应用方差分析及F检验多元回归方程及其系数的显著性.统计分析得到多元回归模型如下:

式中，y为LPD或U的响应值，b0(系统中心点)和bj、bjj、bji为不同的常量系数，xj和 xi为因素温度(θ)、pH和初始接菌量(N0)(其中 i≠j)，e为模型误差［12］.

1.8 预测方程的验证和检验

得到多元回归方程后，在所设试验条件范围内［温度20～30℃，pH6.0～7.0，N0为3 lg N～5 lg N，其中N为菌数/(cfu·g－1)］，设定10组随机数据，按上述方法采用Origin 8.0软件拟合生长曲线，计算生长参数U和LPD.

用所建的二级预测方程对用来建模的20组数据和用来验证的10组数据分别处理预测生长参数U和 LPD，用均方误差(Mean square error，MSE)、偏差因子(Bias factor，BF)和准确因子(Accuracy factor，AF)［13－14］作为衡量模型的标准.公式如下:

式中，Vo为用修正的Gompertz模型拟合生长模型的参数U或LPD的观测值;Vp为用建立的RSM方程得出的对U或LPD的预测值，n为测定重复数［12］.

2 结果与分析

2.1 生长曲线的拟合与生长参数的观测

用修正的Gompertz模型拟合猪肉中气单胞菌的生长曲线，计算生长曲线的参数U和LPD.结果(表2)表明，修正的Gompertz模型可以较好地模拟不同试验条件下冷却猪肉中气单胞菌的生长情况(R2＞0.96).

2.2 RSM生长预测方程的建立和验证

本研究中气单胞菌的生长曲线参数U和LPD都采用了常用对数的变化，以达到均一化目的［12］，然后用逐步回归方法(引入水平为0.05，去除水平为0.10)建立生长曲线参数U和LPD对因素θ、pH和N0的响应曲面模型如下:

方程(6)说明自变量能够解释因变量81.0%的变化，拟合效果较好，对所得RSM模型进行方差分析，模型和各系数显著(P＜0.05)，失拟检验不显著(P＞0.05).方程(7)自变量能够解释因变量72.2%的变化，因自变量N0的概率P＞0.05，所以只有自变量θ和pH进入最后模型中.建立的RSM模型能较好地模拟因素θ、pH和N0对冷却猪肉中气单胞菌的生长曲线参数U和LPD的影响.初始接菌量(N0)对气单胞菌的生长率(U)影响显著.

应用建立的RSM生长预测方程对建模的20组处理和验证的10组处理分别进行生长参数U和LPD的观测和预测(表2和表3).

表2 由Gompertz模型所得出的气单胞菌在不同试验条件下的生长参数1)Tab.2 Growth parameters of Aeromonas spp.obtained from Gompertz model under different experimental conditions

表3 不同试验条件下用于验证的气单胞菌的生长观测和预测结果1)Tab.3 Observed and predicted U and LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation under different combined conditions

2.3 预测方程的数学检验

用来对结果进行验证的组合的预测值与观测值的比较如图1和图2所示.说明所建预测模型可靠性能够接受，可以较好地模拟在本试验条件下冷却猪肉中气单胞菌的生长情况.

图1 应用RSM预测方程对U预测值与观测值的图形比较Fig.1 Graphical comparisons between observed and predicted U of Aeromonas spp.by RSM for validation

图2 应用RSM预测方程对LPD预测值与观测值的图形比较Fig.2 Graphical comparisons between observed and predicted LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation

用于建模试验组合的RSM预测方程的数学固有检验和用于验证试验组合的RSM预测方程的数学扩展检验如表4所示.MSE的值越小，说明模型表达试验数据越充分.用于建模试验组合的U和LPD的 MSE 分别为 2.0 ×10－4和 64.0 ×10－4，而用于验证的分别为0.1 ×10－4和36.0 ×10－4，表示预测值和观测值相似，均方误差较小，表明所得模型可以很好地拟合试验数据.

偏差因子(BF)是衡量模型的一个非常重要的参数，Ross［11］认为，对于微生物生长模型的验证，如果BF值在0.90～1.05的范围之内，认为该模型能够很好地预测微生物生长速度和生长状况;如果BF值在0.7～0.9或者1.06～1.15范围之内，则该模型是可以被接受的;如果BF值大于1.15或者小于0.7，则说明该模型是失败的.这一判断方法也成功用于单增李斯特菌Listeria monocytogenes生长模型的判定［15］.由表4可知，本试验所得用于建模试验组合的U和LPD的BF值分别为0.9807和0.9917，用于验证的分别为0.9898和0.9885，说明建立的模型可以较好地表达微生物的生长状况.当AF=1的时候，说明模型有很高的精确性，数值越大，或者越小，说明该模型的准确性越低［16］.如表4所示，用于建模试验组合的U的AF值都属于可以接受的结果.本试验建立的预测方程适合预测不同试验条件下冷却猪肉中气单胞菌的生长参数.

表4 RSM预测方程的数学固有检验和扩展检验Tab.4 Internal and external mathematical validation by RSM for model validation

3 讨论与结论

本研究仅对猪肉中优势腐败菌之一的气单胞菌开展研究，冷却猪肉中气单胞菌生长情况复杂，影响模型建立的因素很多，冷却猪肉中的气单胞菌菌龄并不完全一样，会对模型的参数产生影响.有研究表明，早期的环境和所处的生长阶段都会对细胞转入新环境后适应和再次生长所用的时间产生影响［16］.另外，冷却猪肉中存在的其他微生物也会对气单胞菌的生长有协同或拮抗作用，已有专门对试验条件下混合菌种的研究［17］，也可用单一的预测模型进行模拟.同时，实际食品环境的复杂性远远高于试验条件组合，一般认为试验条件下的预测会出现Fail－Safe情况，试验条件下得到的生长预测模型在用于生产实践前，要经过实际食品的验证才能真正推广使用.

试验除了将温度作为对微生物生长的主要影响因素加以研究外，还将pH和初始接菌量作为显著影响因素引进了预测方程，从所建的生长预测模型来看，温度、pH都对冷却猪肉中气单胞菌的生长有显著影响，而初始接种量只对气单胞菌生长的最大比生长速率U有影响，对迟滞期LPD的影响则可以忽略.本研究建立的生长预测模型经数学检验预测误差较低，拟合性较好，而且因为试验是基于真正食品环境，比用培养基培养得出的结果更适合用于生产实践.

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