NF-κB、caspase-8 在胃癌中的表达和临床意义

沈俊俊 * 韩 虹 李 静 王燕燕

浙江省湖州市中心医院内科1（313000）中心实验室2 病理科3

恶性肿瘤的发生除细胞增殖失控外，另一个重要原因是肿瘤细胞不能正常凋亡。在死亡受体途径凋亡过程中，caspase-8 活化是凋亡级联反应的第一步，对细胞凋亡起决定性作用。研究发现caspase-8 低表达与多种人类恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤细胞的免疫逃逸有关[1]。转录因子NFκB 是抗凋亡基因表达的主要调节因子，研究显示活化的NF-κB 可通过抑制caspase-8 表达发挥抗凋亡效应[2]，从而参与恶性肿瘤的发生、发展过程。NF-κB 活化与caspase-8 表达在胃癌中是否存在类似联系，目前尚不十分清楚。本研究通过检测NFκB和caspase-8 在胃癌及其配对癌旁非癌组织中的表达，探讨两者在胃癌中的相关性以及两者与胃癌临床病理特征的关系。

材料与方法

一、标本获取

收集湖州市中心医院2008年10月～2011年5月手术切除胃癌标本54例，高分化腺癌10例，中分化腺癌13例，低分化腺癌31例；男28例，女26例，年龄41～75岁，平均（58.3±7.8）岁。取部分标本行病理检查和免疫组化染色，部分-80 ℃冰箱保存，待行RT-PCR。所有胃癌病例均经病理检查证实，患者术前均未接受过放化疗。胃癌组织取自原发灶中央非坏死部分，癌旁组织取自距原发灶边缘≥5 cm 处并经病理检查证实为非癌胃组织。

二、RT-PCR

取约50 mg组织，以TRIzol®试剂（invitrogenTM，Life Technologies Corporation）提取总RNA，紫外分光光度计读取A260nm和A280nm值，计算总RNA 浓度。参照RevertAidTM第一链cDNA 合成试剂盒（Fermentas Molecular Biology Tools,Thermo Fisher Scientific Inc.）说明书进行操作，合成cDNA。

NF-κB、caspase-8和内参照GAPDH 引物由上海英骏生物技术有限公司合成（见表1）。PCR 反应体系内含0.1 μg/μL cDNA 1.0 μL、20 μmol/L 引物P1、P2 各0.5 μL、Premix TaqTM（TAKARA BIO INC.）12.5 μL，加ddH2O 至25 μL。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，NF-κB 55 ℃30 s/caspase-8 58 ℃30 s，72 ℃1 min，NF-κB 30个循环/caspase-8 40个循环；72 ℃10 min。扩增产物4 ℃保存备用。

取5 μL 扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，CBIO-GelProⅡ全自动电泳凝胶成像分析系统（Bio-Rad Laboratories,Inc.）摄像并分析各条带灰度值。目的基因相对表达量=（目的基因灰度值-空白区域灰度值）/（GAPDH 灰度值-空白区域灰度值），公式中各灰度值取随机10 次均值。

三、免疫组化染色

采用免疫组化SP 法。兔抗人NF-κB p65 多克隆抗体、兔抗人caspase-8（p20）多克隆抗体、SP 免疫组化试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。参照试剂盒说明书进行操作。以PBS 分别代替一抗、二抗和SP 试剂作为阴性对照，以已知NF-κB表达阳性的肝癌组织和caspase-8 表达阳性的正常肝组织作为阳性对照。

结果判断：胞质或胞核出现棕黄色颗粒为NFκB 阳性细胞，胞质出现棕黄色颗粒为caspase-8 阳性细胞。每个标本随机选取5个200 倍视野（每视野不少于100个细胞），计数阳性细胞。以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准：（+），阳性细胞数10%～25%；（++），阳性细胞数26%～75%；（+++），阳性细胞数76%～100%。

四、统计学分析

结 果

一、胃癌及其配对癌旁非癌组织中NF-κB、caspase-8 mRNA 表达

胃癌及其配对癌旁非癌组织中均可扩增出NF-κB、caspase-8 基因片段（见图1）。胃癌组织中NF-κB mRNA 相对表达量显著高于癌旁非癌组织（0.624±0.114 对0.280±0.072，t=18.79，P＜0.01），caspase-8 mRNA 相对表达量显著低于癌旁非癌组织（0.154±0.065 对0.394±0.107，t=14.04，P＜0.01）。

表1 NF-κB、caspase-8、GAPDH 引物序列、位置和扩增片段大小

图1 胃癌及其配对癌旁非癌组织中NF-κB、caspase-8 mRNA 表达RT-PCR 电泳图

二、胃癌及其配对癌旁非癌组织中NF-κB、caspase-8 蛋白表达和定位

胃癌组织中NF-κB 蛋白呈条索状、巢状分布，胞核、胞质均呈阳性着色，胞核着色较深；配对癌旁非癌组织中NF-κB 蛋白主要定位于胞质，着色较浅，胞核基本无阳性着色。胃癌组织中NF-κB 蛋白表达强度和表达阳性率显著高于癌旁非癌组织（见表2）。

caspase-8 蛋白主要定位于细胞质，呈深黄色或棕黄色着色，弥漫分布。胃癌组织中caspase-8 蛋白表达强度和表达阳性率显著低于癌旁非癌组织（见表2）。

三、胃癌组织中NF-κB 与caspase-8 的相关性以及两者与胃癌临床病理特征的关系

44例NF-κB 蛋白表达阳性胃癌组织中，caspase-8 蛋白表达阳性11例，阴性33例；10例NF-κB 蛋白表达阴性胃癌组织中，caspase-8 蛋白表达阳性6例，阴性4例。两者在胃癌组织中的表达呈负相关（r=-0.293，P＜0.05) 。胃癌组织中NF-κB mRNA 与caspase-8 mRNA 的相对表达量亦呈负相关（r=-0.686，P＜0.01）。

胃癌组织中的NF-κB 蛋白表达与肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤大小无关；caspase-8 蛋白表达仅与肿瘤分化程度有关，与患者性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、有无淋巴结转移无关（见表3）。

表3 胃癌组织中NF-κB、caspase-8 蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

讨 论

胃癌的发生、发展是一个多基因参与的多阶段过程，与多种细胞因子的异常表达及其信号转导密切相关，细胞增殖与凋亡失衡在此过程中起重要作用。转录因子NF-κB 具有多向调节作用，可调控多种细胞因子、生长因子基因的转录表达，参与细胞增殖和凋亡的调节，由此参与调控体内多种生理和病理过程。NF-κB 异常活化能保护肿瘤细胞免于凋亡，并与肿瘤的发生、侵袭、转移、耐药相关[2～4]，因而逐渐成为肿瘤领域的研究热点。

NF-κB 家族包括RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）五个亚单位，通常情况下它们以同源或异源二聚体的形式存在于胞质中，与NF-κB 抑制蛋白（IκB，主要是IκBα）结合，形成无活性的三聚体，不发挥功能。当细胞受细胞因子、丝裂原、细菌、病毒、射线、药物等刺激后，IκB 通过磷酸化、泛素化被蛋白酶体降解，暴露NF-κB 的核定位信号序列，游离的NF-κB 二聚体进入胞核，与靶基因的κB 位点结合，发挥转录调节作用。研究显示多种人类恶性肿瘤，包括乳腺癌、头颈部癌、食管癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌中存在NF-κB 异常激活[4]。本研究发现胃癌及其配对癌旁非癌组织中均有NF-κB mRNA 表达，胃癌组织中的相对表达量显著高于癌旁非癌组织，提示NF-κB基因过表达与胃癌有关。胃癌组织中NF-κB 蛋白定位于胞核和胞质，表达强度和表达阳性率显著高于癌旁非癌组织，后者仅胞质中有NF-κB 蛋白表达。此种表达和定位特点提示胃癌组织中的NF-κB信号通路被激活，大量活化的NF-κB 进入胞核发挥转录调节作用，参与胃癌的发生、发展过程。本研究还发现胃癌组织中的NF-κB 蛋白表达与肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移有关，低分化、侵及浆膜、发生淋巴结转移的胃癌，NF-κB 蛋白表达阳性率显著增高，提示NF-κB 高表达是提示胃癌恶性程度高、预后差的重要指标。

表2 胃癌及其配对癌旁非癌组织中NF-κB、caspase-8 蛋白表达比较

caspase-8 是死亡受体介导的凋亡信号通路中的关键启动子。死亡受体与配体结合后发生寡聚化，募集接头蛋白FADD和caspase-8 前体procaspase-8 形成死亡诱导信号复合物（DISC），procaspase-8 自身切割活化为caspase-8，进一步激活下游caspases 包括caspase-3、6、7，启动细胞凋亡[1]。研究显示caspase-8 基因启动子区甲基化、基因突变所致的caspase-8 低表达与多种人类恶性肿瘤的发生、发展、复发有关[5.6]。本研究胃癌组织中caspase-8 mRNA 相对表达量以及caspase-8 蛋白表达强度和表达阳性率均显著低于癌旁非癌组织，提示胃癌细胞增殖失控与caspase-8 表达受抑有关；低分化胃癌的caspase-8 蛋白表达阳性率显著低于高中分化胃癌，进一步提示caspase-8 低表达与胃癌的发生、发展相关。然而本研究发现caspase-8 蛋白表达与胃癌浸润深度和有无淋巴结转移无关，表明caspase-8 用于评估胃癌侵袭、转移的价值不大。

caspase-8 为NF-κB 的下游靶基因。本研究发现胃癌组织中NF-κB 高表达而caspase-8 低表达，NF-κB mRNA和蛋白表达分别与caspase-8 mRNA和蛋白表达呈负相关，提示NF-κB 可能通过某种途径抑制caspase-8 表达，参与了胃癌的发生、发展过程。c-FLIP 在caspase-8 的活性调节中起关键作用，其可竞争性结合FADD，阻止后者与procaspase-8 结合形成DISC，进而抑制procaspase-8 活化[7]。有研究指出活化的NF-κB 可通过上调c-FLIP 表达抑制Fas/FasL-FADD-caspase-8 信号通路活化，由此发挥抗凋亡效应[2]。caspase-8 亦可激活NF-κB[8]，从而产生明显的正反馈效应。至于胃癌中是否存在与上述类似的信号通路，需进一步研究证实。

综上所述，胃癌的发生、发展机制复杂，多种基因、蛋白、细胞因子及其信号通路参与其中。caspase-8 是胃癌细胞凋亡过程中的重要调节因子，NF-κB 则为参与胃癌发生、发展信号通路网络的中心环节。本研究结果提示NF-κB 信号通路活化参与了胃癌的发生、发展过程，其活化可能通过下调caspase-8 表达发挥抗凋亡效应；NF-κB 表达与胃癌分化程度、浸润深度和有无淋巴结转移有关，可在一定程度上提示胃癌患者的预后；caspase-8 表达与胃癌分化程度有关，其意义有待进一步研究。深入探讨这两种因子与胃癌的关系，将为胃癌的早期诊断和基因治疗提供理论依据。

1 徐智芳，王建祥.Caspase 8 与肿瘤的发生[J].医学分子生物学杂志,2007,4 (4) :331-334.

2 Karin M.Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression[J].Nature,2006,441 (7092):431-436.

3 Lin Y,Bai L,Chen W,et al.The NF-kappaB activation pathways,emerging molecular targets for cancer prevention and therapy[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14 (1):45-55.

4 Brown M,Cohen J,Arun P,et al.NF-kappaB in carcinoma therapy and prevention[J].Expert Opin Ther Targets,2008,12 (9):1109-1122.

5 Martinez R,Setien F,Voelter C,et al.CpG island promoter hypermethylation of the pro-apoptotic gene caspase-8 is a common hallmark of relapsed glioblastoma multiforme[J].Carcinogenesis,2007,28 (6):1264-1268.

6 Soung YH,Lee JW,Kim SY,et al.CASPASE-8 gene is inactivated by somatic mutations in gastric carcinomas[J].Cancer Res,2005,65 (3):815-821.

7 Bagnoli M,Canevari S,Mezzanzanica D.Cellular FLICEinhibitory protein (c-FLIP) signalling:a key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(2):210-213.

8 Maelfait J,Beyaert R.Non-apoptotic functions of caspase-8[J].Biochem Pharmacol,2008,76 (11):1365-1373.