乳香中三萜类成分的薄层色谱鉴别和含量测定

佟昕，刘汶，梁晓旭，齐文，潘英妮，华会明，刘晓秋*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110000）

乳香中三萜类成分的薄层色谱鉴别和含量测定

佟昕1，刘汶2，梁晓旭1，齐文1，潘英妮1，华会明1，刘晓秋1*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110000）

目的：以乳香中主要三萜类成分为指标，建立和完善乳香的定性定量分析方法。方法：用TLC鉴别法，以三萜酸类成分11-羰基-β-乙酰－乳香酸（AKBA）为对照品，采用硅胶GF254薄层板，以环己烷－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶2∶0.2）为展开剂，鉴别乳香药材中AKBA；用HPLC测定方法，Agilent TC-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-0.05%磷酸溶液（80∶20）为流动相，流速：0.8mL·min－1，检测波长：250nm，测定不同来源乳香药材中AKBA和11-羰基-β-乳香酸（KBA）含量。结果：乳香TLC图谱中，AKBA斑点清晰、分离效果好；HPLC含量测定法中，AKBA和KBA分别在0.024 63～0.246 3mg·mL－1和0.010 04～0.100 4mg·mL－1，线性关系良好。AKBA和KBA的回收率分别为96.1%（RSD＝3.1%）和96.4%（RSD＝3.5%）。结论：所建立的TLC和HPLC法操作简便、结果准确、重复性好，可作为乳香定性、定量的质量控制方法。

乳香；三萜类成分；鉴别；含量测定

乳香（Olibanum）为橄榄科植物卡氏乳香树Boswellia carteriiBirdw.及同属植物鲍达乳香树Boswellia bhaw-dajianaBirdw.树皮渗出的树脂。根据药材产地不同，被称为索马里乳香和埃塞俄比亚乳香。乳香中主要成分是树脂、挥发油、树胶等［1］，其中树脂中主要三萜类化合物有11-羰基-β-乳香酸（KBA）、11羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）、β-乳香酸、3-乙酰-β-乳香酸等，具有抗炎、抑制肿瘤、抗菌、抗氧化［2］、抗血小板凝集［3］和免疫抑制［4］等作用。《中国药典》2010版（一部）中索马里乳香和埃塞俄比亚乳香分别以挥发油成分α-蒎烯和醋酸辛酯作为鉴别指标；以挥发油总量为含量测定指标，规定挥发油含量分别不得低于6.0%和2.0%。文献报道以气相色谱－质谱联用法［5］鉴定乳香挥发油成分，以薄层色谱方法鉴别乳香中挥发性成分［6］。孙磊等［7］、王淳等［8］对乳香中三萜酸类成分进行了含量测定。笔者研究表明在乳香中AKBA和KBA含量稳定，可作为质量控制指标。为此，建立了乳香中特有三萜类成分AKBA的TLC鉴别法及HPLC同时测定AKBA和KBA含量。所建立的方法操作简便，分离度高，精密度和准确度均符合要求，为新版《中国药典》乳香质量标准的修订提供依据。

1 仪器、材料和试剂

ZF-1型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂），SHIMADZU高效液相色谱仪（日本岛津公司，LC-10Atvp泵，DAD检测器，Class-vp工作站），AB135-S天平（METTLER TOLEDO仪器有限公司）。硅胶GF254薄层板（自制）。

对照品AKBA、KBA均为自制（HPLC纯度大于98.0%），化学结构见图1；乙腈色谱纯（广州百灵威试剂公司），纯净水（杭州娃哈哈有限公司），其他试剂均为分析纯；乳香样品No.1～2产自印尼，No.3～10产自埃塞俄比亚，No.11～12产自索马里，No.13产自印度。经沈阳药科大学中药学院王延年副教授鉴定No.1～13为正品，No.14为掺伪品，No.15为伪品。

2 方法和结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 取AKBA对照品，加甲醇制成每1mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取乳香样品100 mg，加甲醇10mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

图1 AKBA和KBA的化学结构

2.1.2 色谱条件和样品鉴别 分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1μL，点于同一硅胶GF254薄层板，以环己烷－乙酸乙酯 －冰醋酸（10∶2∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下观察。No.1～13供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的暗斑；No.14供试品色谱中，与对照品色谱相应位置上的斑点轮廓不清晰，Rf值0.6处有杂质斑点；No.15供试品色谱中，与对照品色谱相应位置上未见斑点（见图2）。

图2 乳香的薄层色谱图

2.2 AKBA和KBA的HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（80∶20），检测波长为250nm，柱温为30℃，进样量为20μL。该色谱条件下，理论塔板数按AKBA峰计算不得小于5 000。AKBA和KBA均达到基线分离（见图3）。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取AKBA和KBA对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1mL含AKBA 0.493 mg，KBA 0.201 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品（No.11）粉末约60 mg，精密称定，精密加甲醇25mL，密塞，称定重量。超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量。以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

图3 对照品（A）和供试品（B）HPLC图

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL置5mL量瓶中，制成系列混合对照品溶液。分别吸取20μL，注入液相色谱仪，以测得的峰面积积分值为纵坐标，以对照品浓度（mg·mL－1）为横坐标，绘制标准曲线，AKBA的回归方程为Y＝2.655×107X＋2.062×105，r＝0.999 4，表明AKBA在0.024 63～0.246 3 mg·mL－1线性关系良好。KBA的线性方程为Y＝2.356×107X＋1.494×105，r＝0.999 4，表明 KBA在0.010 04～0.100 4 mg·mL－1线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，AKBA和 KBA浓度分别为 0.098 5 mg·mL－1和0.040 2 mg·mL－1，按上述色谱条件，连续进样6次，AKBA和 KBA的平均峰面积是2 882 279和1 084 302，峰面积的 RSD分别为1.4%和1.6%。结果表明，精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取样品（No.11）粉末6份，按供试品溶液制备方法处理，进行测定，样品中AKBA和KBA的含量分别为3.80%和1.44%，计算RSD分别为2.0%和2.4%。结果表明，方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（No.11），在制备后0，2，4，6，8 h进样测定，测定色谱峰面积，AKBA和KBA的平均峰面积为2 922 371和876 687，峰面积的RSD分别为0.85%和2.3%。表明供试液制备后8 h内稳定性良好。

2.2.8 回收率试验 采用加样回收率试验方法，取已知含量的样品（No.11）6份，每份30 mg，分别精密加入 AKBA对照品溶液（2.472 mg·mL－1）0.5mL和 KBA对照品溶液（0.924 mg·mL－1）0.5mL。按2.2.3项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，计算回收率，结果如表1所示。

表1 回收率试验

2.2.9 样品测定 取13批乳香样品，按2.2.3项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，以外标一点法计算AKBA和KBA含量，结果见表2。

表2 乳香药材中AKBA和KBA含量测定／%

3 讨论

乳香中含树脂60%～70%（主要为三萜类化合物）、树胶20%～30%、挥发油3%～8%。树脂中含有大量乳香酸类成分，其中β-乳香酸和3-乙酰-β-乳香酸在不同来源和批次样品中含量相差约4倍以上，与文献中报道［8］一致，不宜作含量测定指标成分。而AKBA和KBA为乳香主要活性成分［2］，具有明显的抗炎、抗肿瘤活性，且在分子中有共轭结构，紫外250nm处有最大吸收，含量稳定，采用等度洗脱，易于检测，适合作为乳香定量检测的指标成分。建议新版《中国药典》以AKBA、KBA两者之和来规定指标成分的含量。含量限度值有待累计更多批数样品数据后确定。

AKBA与10%硫酸－乙醇溶液和5%香草醛－浓硫酸溶液均无显色反应，鉴于AKBA具有紫外吸收，故采用硅胶GF254板，观察其在紫外灯（254nm）下暗斑。考察了石油醚－乙酸乙酯－丙酮、二氯甲烷－甲醇和环己烷－乙酸乙酯－冰醋酸展开系统，最终选定环己烷－乙酸乙酯－冰醋酸系统，所得斑点清晰、分离度好，且Rf值适当。图2中No.1～13可见乳香样品中均有与AKBA Rf值相对应的斑点，因此，AKBA可作为乳香薄层鉴别的特征性成分。所建立的TLC法，简便易行，专属性强，可对乳香及掺伪品和伪品进行有效鉴别。

在No.14样品的薄层色谱中，与AKBA Rf值相对应的斑点模糊，说明含量较低，结合性状观察，表明样品透明度差，推测其掺入杂质。No.15样品的薄层色谱中，未见与AKBA Rf值相对应的斑点，证明是伪品。将样品粉末与碘反应，正品乳香与碘无颜色反应，而No.14掺伪品和No.15伪品与碘反应显蓝色，推测可能存在淀粉。

［1］崔征.生药学［M］.北京：人民卫生出版社，2005：161-162.

［2］常允平，韩英梅，张俊艳.乳香的化学成分和药理活性研究进展［J］.现代药物与临床，2012，27（1）：1-8.

［3］Choi OB，Park JH，Lee YJ，et al.Olibanum extract inhibits vascular smooth muscle cell migration and proliferation in response to platelet-derived growth factor［J］.Korean J Physiol Pharmacol，2009，13（2）：107-113.

［4］Knaus U，Wagner H.Effects of boswellic acid of Boswellia serrata and other triterpenic acids on the complement syste［J］.Phytomedicine，1996，3（1）：77-80.

［5］石上梅，田金改，王宝琴.进口乳香药材的检测方法研究［J］.中国中药杂志，2002，27（3）：170-173.

［6］吴芳，李涛，乔蓉霞，等.乳香及其炮制品检测方法的改进［J］.中药材，2008，31（12）：1794-1795.

［7］孙磊，刘丽娜，金红宇，等.乳香、制乳香含量测定研究［J］.中国药事，2010，24（10）：972-974.

［8］王淳，夏磊，宋志钱，等.乳香中5种乳香酸成分含量测定［J］.中国中药杂志，2011，36（10）：1330-1333.

Qualitative and Quantitative Analysis of Triterpenes in Olibanum by TLC and HPLC

TONG Xin1，LIUWen2，LIANG Xiao-xu1，QIWen1，PAN Ying-ni1，HUA Hui-ming1，LIU Xiao-qiu1
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2.Shenyang Institue for Food and Drug Conctrol，Shenyang 110000，China）

Objective：To establish and improve the qualitative and quantitative analysis of triterpenes in the Olibanum.Methods：TLC was used for qualitative analysis of triterpenes in the Olibanum，silica gel GF254，mixed with sodium carboxymethyl cellulose as the coating substance and cyclohexane-ethyl acetate-glacial acetic acid（10∶2∶0.2）as mobile phase，and triterpene acids composition of Olibanum as reference substance namely acetyl-11-keto-β-boswellic acid（AKBA）.HPLCmethod was used for quantitative analysis of AKBA and 11-keto-β-boswellic acid（KBA），using Agilent TC-C18column（250mm×4.6mm，5μm）.Themobile phasewas amixture of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（80∶20）.The flow rate was 0.8mL·min－1.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 250nm.Results：The TLCmethod had high sensitivity and showed clear spots of AKBA.The recoveries of AKBA and KBA by HPLCmethod were 96.1%（RSD＝3.1%）and 96.4%（RSD＝3.5%），respectively.Conclusion：TLC and HPLCmethods are simple，accurate and repeatable.Themethods can be used for the quality control of Olibanum.

Olibanum；Triterpenes；Qualitative；Quantitative analysis

*［通讯作者］刘晓秋，E-mail：liuxiaoqiu3388＠tom.com

2012-03-28）