TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

张建军 王博 田元 张景辉 吴河水

·论著·

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

张建军 王博 田元 张景辉 吴河水

目的构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，转染胰腺癌细胞，并筛选出稳定转染的克隆细胞株。方法采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA，构建3个质粒表达载体，分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3；选取抑制效率最高的shRNA质粒，采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞；实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率；G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系。结果转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)%。转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4 mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006，均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均<0.05)。以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79±8.16)%，较瞬转细胞显著提高(P=0.001)；TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001)；TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)%，显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)%和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)%(P=0.000)。结论成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞。

胰腺肿瘤； Toll样受体4； 转染； RNA干扰

Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)主要表达于上皮细胞和免疫细胞，在宿主防御反应中起着重要作用[1]。近年来发现，TLR4在很多肿瘤细胞和肿瘤组织中表达上调[2]。我们曾报道TLR4在胰腺癌中高表达，且与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及临床分期相关[3]。因此，TLR4可能成为治疗胰腺癌的新靶点。本研究应用RNA干扰(RNAi)技术构建靶向TLR4的质粒，转染人胰腺癌PANC1细胞，筛选稳转细胞克隆。

材料和方法

一、靶向TLR4表达质粒的构建

用siRNA WizardTMInvivogen软件设计3个靶向人TLR4基因cDNA序列的短发夹RNA(shRNA)，并应用在线软件BLAST检索数据库排除其他基因的同源性序列，其顺序为 BamH酶切位点、19 nt正义序列、9 nt loop接头序列、19 nt反义序列、 12 nt RNA聚合酶终止子(6个T)、Hind酶切位点，分别命名为TLR4-1、TLR4-2和TLR4-3(表1)。携带绿色荧光蛋白(GFP)的TLR4 shRNA 表达质粒由上海吉凯基因公司构建，并经测序证实。阴性对照质粒为该公司提供的携带 GFP的空质粒载体。

表1 TLR4 shRNA构建框架序列

二、TLR4 shRNA表达质粒转染细胞

胰腺癌细胞系PANC1由协和医院普外科实验室提供,常规培养传代。取对数生长期细胞， 以2×105个/孔接种至6孔板中培养24 h，应用LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)将质粒转染细胞，按试剂盒说明书操作。在荧光显微镜下观测转染细胞GFP表达，并收集细胞上流式细胞仪检测GFP表达，计算转染效率。

三、实时定量PCR检测TLR4 mRNA的表达

用Trizol提取转染后细胞总RNA，随机引物法逆转录合成cDNA。应用荧光实时定量PCR盒(Promega公司)检测TLR4 mRNA表达。 TLR4引物上游5′-ACCTGTCCCTGAACCCTATGAA-3′，下游5′-CTTCTAAACCAGCCAGACCTTG-3′ ，产物138 bp；内参β-actin引物上游5′-AAGGCCAGGTAATTGTCACG-3′，下游5′-AGCAGCTCTGCAGTACGTC-3′，产物105 bp。PCR反应程序：94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共45个循环。 PCR结果采用2-△△Ct分析法[4]计算。

四、流式细胞仪检测TLR4蛋白表达

胰酶消化转染细胞，PBS洗涤后调整细胞浓度为106个/ml。取200 μl细胞悬液，加入藻红蛋白(phycoerythrin)标记的TLR4抗体(eBioscience公司)5 μl，4℃避光孵育30 min，上流式细胞仪检测。

五、稳定转染TLR4 shRNA的细胞克隆筛选

选取沉默效率最佳的RNAi质粒转染细胞，按1∶10比例传代于6孔板，细胞贴壁后用含G418(400～1000 mg/L)的培养基培养2周，挑取单个细胞集落，运用有限稀释单克隆形成法稀释后，按每孔1个细胞接种于96孔板，继续采用800 mg/L G418筛选。1个月后观察单克隆形成情况，挑选绿色荧光强度最高的克隆进行扩大培养。

六、统计学分析

结 果

一、细胞瞬时转染效率及TLR4 mRNA表达

重组质粒转染PANC1细胞48 h后,荧光显微镜下见细胞形态无明显改变，但表达GFP(图1a)，瞬转效率为(46.72±5.06)%(图1b、c)。

转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006，均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均<0.05)。3个转染组间比较差异无统计学意义，但以TLR4-3的沉默效果最佳。

图1转染48 h的PANC1细胞(a，荧光显微镜 ×100)及未转染细胞(b)和转染细胞(c)的荧光表达细胞比例(流式细胞仪)

二、 稳转细胞的GFP表达及TLR4 mRNA表达

稳转细胞广泛表达GFP(图2a)，GFP表达率(转染效率)为(82.79±8.16)%(图2b、c)，显著高于瞬转细胞的(46.72±5.06)%(P=0.001)。稳转细胞的TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002，显著低于瞬转细胞的0.019±0.006(P=0.001)。

图2稳转细胞的GFP表达(a，荧光显微镜 ×100)及未转染细胞(b)和稳转细胞(c)的荧光表达细胞比例(流式细胞仪)

三、稳转细胞的TLR4蛋白表达

稳转细胞TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)%，显著低于未转染组的(87.42±5.00)%(P=0.000)及阴性对照转染组的(82.9±5.00)%(P=0.000, 图3)。

图3未转染细胞(a)及稳转细胞(b)的TLR4蛋白表达(流式细胞仪)

讨 论

RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以应用体外转录或化学合成siRNA,经脂质体或病毒载体转染细胞，或应用shRNA表达载体转染细胞后特异地沉默特定基因。化学合成siRNA抑制作用时间短,成本昂贵,并且易于污染 RNA酶；而shRNA转染细胞后可以在RNA酶的作用下被切割成与体外合成siRNA相同的序列与结构。因细胞可稳定持续地表达shRNA,从而使RNAi作用持续时间更长、更稳[5]。

近年研究发现，TLR4在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达上调[6-7]。我们以往的研究也显示TLR4在胰腺癌组织中高表达[3]。因此本研究设计合成了3个靶向TLR4的shRNA，将其插入U6 RNA聚合酶 Ⅲ启动子、卡那耐药基因、GFP基因的真核表达质粒，具有利用相对单一的启动子和终止序列产生大量的小RNA，利于稳定传代细胞株的筛选及在荧光显微镜下观察或流式细胞仪检测等优势。本研究结果显示，3个shRNA表达质粒转染细胞后均获得满意瞬间转染效率及基因沉默效应，选择转染率最高、基因沉默效应最佳的TLR4-3表达质粒转染PANC1细胞所获得的稳转细胞，其转染效率显著高于瞬转细胞，目的基因的抑制效应亦优于瞬转细胞，为以 TLR4为靶点的胰腺癌细胞生物学特性研究提供了良好基础。

[1] Beutler B. Endotoxin, toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity. Curr Opin Microbiol, 2000,3:23-28.

[2] Rakoff-Nahoum S, Medzhitov R. Toll-like receptors and cancer. Nat Rev Cancer,2009,9:57-63.

[3] Zhang JJ, Wu HS, Wang L, et al. Expression and significance of TLR4 and HIF-1 alpha in pancreatic ductal adenocarcinoma. World J Gastroenterol, 2010,16:2881-2888.

[4] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001,25:402-408.

[5] Liu XD, Ma SM, Liu Y, et al. Short hairpin RNA and retroviral vector-mediated silencing of p53 in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 2004,324:1173-1178.

[6] Zhou M, McFarland-Mancini MM, Funk HM, et al. Toll-like receptor expression in normal ovary and ovarian tumors. Cancer Immunol Immunother, 2009,58:1375-1385.

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ConstructionofTLR4shRNAplasmidandscreeningofhumanpancreaticcancerPANC1celllinewithstabletransfection

ZHANGJian-jun,WANGBo,TIANYuan,ZHANGJing-hui,WUHe-shui.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,NanshanHospital,GuangdongMedicalCollege,Shenzhen518052,China

WUHe-shui,Email:heshuiwu@163.com

ObjectiveTo construct the eukaryotic plasmid expression vector mediated short hairpin RNA(shRNA) interference targeting TLR4 gene, and transfect it into pancreatic adenocarcinoma cell line PANC1, then screen stably transfected clonal cell line.MethodsThree shRNA interference expression plasmid vectors targeting the TLR4 gene were constructed, named TLR4-1, TLR4-2, TLR4-3.The shRNA plasmid with highest inhibitory efficiency was selected and transfected into PANC1 cells with liposome. The silencing efficiency and transfection efficiency of TLR4-shRNA was assayed with real-time quantitative PCR and flow cytometry analysis. Monoclonal cell with stable transfection of TLR4-shRNA were selected by geneticin 418(G418) and limiting dilution analysis.ResultsTransient transfection efficiency of PANC1 was (46.72±5.06)%. TLR4 mRNA expressions were 0.025±0.004,0.027±0.003,0.019±0.006in cells transfected with TLR4-1, TLR4-2, TLR4-3, respectively, which were significantly lower than that in untransfected group (0.061±0.018) and negative control group (0.057±0.015,P<0.05). The transfection efficiency of TLR4-3 vector in stably transfected clones [(82.79±8.16)%] was significantly higher than that of transient transfection (P=0.001). The expression of TLR4 mRNA was decreased to 0.010±0.002, which was significantly lower than that of transient transfection (P=0.001). The expression of TLR4 protein was (0.54±0.32)%, which was significantly lower than that of untransfected cells [(87.42±5.00)%] and that of negative control [(82.9±5.00)%,P=0.000].ConclusionsStable transfection PANC1 cell lines with TLR4 gene silencing are successfully identified.

Pancreatic neoplasms; Toll like receptor 4; Transfection; RNA interference

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.012

国家自然科学基金(30972898)

518052 深圳，广东医学院附属南山医院胃肠外科(张建平)；华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心(张建军、王博、田元、张景辉、吴河水)

吴河水，Email：heshuiwu@163.com

2011-11-25)

(本文编辑：吕芳萍)