重症急性胰腺炎患者治疗前后血清蛋白组学的变化

任俊 余开焕 马鹏 余佳 陈辰 张爱民

·论著·

重症急性胰腺炎患者治疗前后血清蛋白组学的变化

任俊 余开焕 马鹏 余佳 陈辰 张爱民

目的比较重症急性胰腺炎(SAP)患者治疗前后血清蛋白质组表达差异，寻找能够判断SAP病情好转的血清蛋白质。方法利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)分析20例SAP患者治疗前及治疗后7 d的血清蛋白质谱，并进行APACHEⅡ评分。结果SAP患者治疗后7 d的APACHEⅡ评分为(10.70±3.47)分，显著低于入院时的(13.00±2.21)分(t=4.272,P=0.002)。治疗前后一共检测到血清中132个蛋白质峰，其中质荷比2000至40 000间有27个差异蛋白质峰(P<0.05)。分子质量47 000的蛋白在SAP病情缓解后表达下调，分子质量115 000及159 000的蛋白在SAP治疗后明显上调。结论用SELDI-TOF-MS技术能检出SAP患者治疗前后血清蛋白质的差异表达，分子质量115 000和159 000蛋白的上调及47 000蛋白的下调可能是SAP病情好转的征兆。

胰腺炎，急性坏死性； 蛋白质组； 血清； 预测和判断

目前临床上有多种预测急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)严重程度的方法[1-2],其中以APACHE Ⅱ评分最为常用，也得到了广泛的认可，但其评分项目繁多，计算方法复杂，临床使用价值有限[3]。因此需要寻找能够判断AP严重程度和预后的简单而实用的特异性标志物。本研究检测重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者在治疗前后血清蛋白质谱表达的差异，以筛选反映SAP治疗效果和预后的蛋白质。

材料和方法

一、临床资料

选取2010年7月至12月武汉大学人民医院肝胆外科收治的临床资料完整的20例SAP患者为研究对象，其中男性11例，女性9例，平均年龄(45±18)岁。发病至入院平均时间为(7±4)h，且未做任何治疗。所有患者诊断均符合2007年《重症急性胰腺炎诊治指南》的标准[4]。入院后均行常规个体化综合非手术治疗。入院第1天及治疗后7 d进行APACHEⅡ评分。

二、血清蛋白组学检测

治疗前及治疗后7 d各抽取外周静脉血2 ml，3000 r/min离心10 min，取血清，置-80℃保存。

检测前4℃下融解血清，每10 μl血清中加入20 μl U9裂解液(9 mol/L urea，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，1% DDT,pH9.0)孵育30 min，加入370 μl WCX缓冲液(50 mmol/L NaAc，pH4.5)稀释。每个PCR管中加入50 g/L WCX磁珠100 μl，置磁性分离板上分离2 min，弃去上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl活化2次。活化的纳米磁珠中加入100 μl处理好的血清样品，震荡孵育1 h，置磁性分离板上分离2 min，弃上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl洗涤2次，用10 μl 1% TFA洗脱结合在磁珠上的蛋白，取5 μl蛋白洗脱液加5 μl SPA饱和液(50% ACN+0.5% TFA)充分混合，取2 μl混合液点样于仅起载体作用的金芯片上(Au-chip.Biorad),自然风干，采用SELDI-TOF-MS(BIORAD)采集蛋白表达谱。

仪器主要参数：激光强度175，检测灵敏度6，优化分子质量范围1000～20 000，最高分子质量为50 000。收集样品点数100次。数据收集分子质量范围1000～50 000。先用信噪比(s/n)>5和>2各过滤一次。筛出的质荷比峰在10%以上的样本中同时存在，且同一质荷比峰在不同样本中的偏差<0.3%(以去除原始数据中的噪声)。经上述处理后，用Ciphergen proteinchip3.1软件自动采集数据，根据所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质谱图，其中纵坐标为波峰强度，即蛋白质相对含量，横坐标为质荷比(M/Z)，即蛋白质相对分子质量。

三、统计学处理

结 果

一、APACHEⅡ评分的变化

SAP患者入院第1天的APACHEⅡ评分为(13.00±2.21)分，治疗后7 d的APACHEⅡ评分为(10.70±3.47)分，两者差异具有统计学意义(t=4.272，P=0.002)，表明SAP病情缓解。

二、差异表达蛋白的筛选

SAP患者治疗前后血清中一共检测到132个蛋白质峰，质荷比在2000～40 000间有27个差异表达蛋白质(P<0.05)，其中分子质量47 000的蛋白在SAP病情缓解后表达下调，分子质量115 000及159 000的蛋白在SAP治疗后明显上调(图1)。

图1治疗前(1)后(2)分子质量47 000(a)、115 000(b)、159 000(c)蛋白的质谱图

讨 论

SAP患者约占AP的15%～20%，常出现危及生命的全身并发症或局部并发症，病死率可达15%～56%[5]。AP时胰腺最早的改变是局部的炎症伴随着消化酶颗粒的激活，继而表现全身炎症反应，最终导致多器官损伤。胰腺内外及细胞内外的各种因素均参与AP的病理生理改变，在局部和全身的炎症反应中起着重要作用[6]。Fétaud1等[7]证实，AP时的炎症可增加血管通透性，使胰腺局部蛋白及炎症介质进入血液，导致AP血清蛋白质也发生相应的改变。我们前期实验应用SELDI-TOF-MS技术检测SAP和轻症急性胰腺炎(MAP)大鼠血清蛋白质组学，发现分子质量在9500和9700的蛋白表达下降是MAP向SAP转化的征兆[8]。Papachristou等[9]也发现SAP患者血清分子质量43 000和117 000的两个蛋白明显不同于MAP患者，其中分子质量117 000蛋白区分MAP和SAP的敏感性接近100%，特异性达81%。本研究应用SELDI-TOF-MS技术检测SAP患者治疗前后的血清蛋白质谱的变化，发现27个差异表达蛋白质，其中分子质量47 000、115 000及159 000蛋白的差异最为明显，47 000蛋白在SAP病情缓解时表达减少，而115 000及159 000蛋白则表达增加。提示分子质量47 000蛋白表达下调、115 000和159 000蛋白表达上调可能是SAP患者治疗后病情缓解的预兆，为临床评估SAP的严重程度及治疗效果提供新的指标。

[1] Ranson JH, Rifkind KM, Roses DF, et al. Prognostic signs and the role of oprative management in acute pancreatitis. Surg Gynecol Obstet, 1974, 139:69-81.

[2] Balthazar EJ, Robinson DL, Megibow AJ, et al. Acute pancreatitis:value of CT in establishing prognosis.Radiology,1990,174:331-336.

[3] 李新, 钟碧慧, 晁康, 等. 急性胰腺炎严重程度预测方法新进展.中华胰腺病杂志, 2011,11:375-377.

[4] 中华医学会外科学分会胰腺外科学组.重症急性胰腺炎诊治指南.中华外科杂志, 2007, 45:727-729.

[5] Casas JD, Díaz R, Valderas G, et al. Prognostic value of CT in early assessment of patients with acute pancreatitis. AJR, 2004, 182:569-574.

[6] Pandol SJ, Saluja AK, Imrie CW, et al. Acute pancreatitis: bench to the bedside. Gastroenterology, 2007, 132:1127-1151.

[7] Fétaudl V, Frossard JL, Farina A, et al. Proteomic profiling in an animal model of acute pancreatitis. Protemics, 2008, 8:3621-3631.

[8] 余开焕, 任俊, 黄运涛, 等. 急性胰腺炎大鼠血清蛋白质组学分析.中华胰腺病杂志, 2011,11:329-331.

[9] Papachristou GI, Malehorn DE, Lamb J, et al. Serum proteomic patterns as predictor of severity in acute pancreatitis. Pancreatology, 2007,7:317-324.

Serumproteomicanalysisofpatientwithsevereacutepancreatitisbeforeandaftertreatment

RENJun,YUKai-huan,MAPeng,YUJia,CHENChen,ZHANGAi-min.

DepartmentofHepatobiliary&LaparoscopicSurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

YUKai-huan,Email:yukaihuan@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the different expression of the serum proteome of patient with severe acute pancreatitis (SAP) before and after treatment, and search for the protein that can predict SAP improvement.MethodsSELDI-TOF-MS was used to analyze the expression of serum protein spectrum of 20 SAP patients before treatment and 7 days after treatment, and make the APACHEⅡ score at the same time.ResultsThe APACHEⅡ score was 10.70±3.47 in patients with SAP 7 days after treatment, which were significantly lower than that before treatment (13.00±2.21,P<0.05). One hundred thirty-two spectral peak clusters were detected before and after treatment, there were 27 proteins that had significantly different signal intensities had been detected from 2000 Da to 50000 Da (P<0.05). The peak cluster at 47 000 Da was significantly down-regulated after SAP attenuation. While the peak clusters at 11 700 Da and 15 900 Da were significantly up-regulated after treatment.ConclusionsSerum analysis with SELDI-TOF MS can detect the different expression of the SAP serum proteomics before and after treatment, the increased expression of the protein with molecular weight of 11 500 Da and 15 900 Da and the decreased expression of 4700 Da may be a signal of improvement of SAP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Proteome; Serum; Forecasting

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.001

湖北省自然科学基金(131349)

430060 武汉，武汉大学人民医院肝胆腔镜外科

余开焕，Email:yukaihuan@medmail.com.cn

2011-11-22)

(本文编辑：吕芳萍)