杂草和水稻梨孢菌亲缘关系研究

毛雪琴， 邱海萍， 张 震， 姜 华， 柴荣耀， 王教瑜， 王艳丽， 孙国昌， 杜新法

(浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021)

毛雪琴，邱海萍，张 震，等. 杂草和水稻梨孢菌亲缘关系研究[J]. 杂草科学，2012，30(4)：26-29.

杂草和水稻梨孢菌亲缘关系研究

毛雪琴， 邱海萍， 张 震， 姜 华， 柴荣耀， 王教瑜， 王艳丽， 孙国昌， 杜新法

(浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021)

利用12个引物的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)对来自18种寄主的49个梨孢菌株进行了亲缘关系分析，从DNA电泳谱带中可以直观地看出，来自同一种或同一属或亲缘关系相近寄主上的梨孢菌带型较相似，相反，亲缘关系较远的寄主上的梨孢菌带型差异较大，茭白、碎米莎草和马唐寄主上的梨孢菌的谱带均非常特异，与牛筋草和狗尾草等其他15种寄主的梨孢菌有较大差异，牛筋草和狗尾草等15种寄主的梨孢菌存在比较多的共有谱带。对引物S380扩增的RAPD谱带进行聚类分析表明，18种寄主上的49个梨孢菌株可分为5个类群。种与种之间的DNA( RAPD谱带)电泳谱带差异非常明显，而种内品种间的带型差异比较小。

梨孢菌； 随机扩增多态性DNA(RAPD)； 聚类分析

梨孢菌(Pyriculariasp.)是重要的植物病原菌，以往对梨孢菌分类的依据是分生孢子、附着胞和分生孢子梗的形态学差异。但梨孢菌的形态变异性较大，环境条件和营养条件的不同往往引起孢子大小的差异。传统的分类系统不够完善，在学名的使用上较混乱，文献中常出现同种异名和异种同名。生化技术作为辅助手段已在一些物种的分类中得到了应用，Leung等[1]和Borrmeo等[2]曾报道一些寄主上的梨孢菌的可溶性蛋白、非特异性酯酶、过氧化物同工酶及RFLP谱带存在稳定的差异，某些寄主上的梨孢菌具有特征性谱带。但应用分子技术结合形态学、有性阶段形成及交互致病性研究，将梨孢菌进行系统分类尚未见报道。不同国家和地区由于生态条件的差异，植被种类及梨孢菌的种群结构不同。广泛收集具有生态差异的各种寄主上的梨孢菌，进行系统的交互致病性、形态学、蛋白质和DNA分子标记研究，明确不同寄主上的梨孢菌的交互致病性、亲缘关系和系统分类学地位，具有真菌分类学上的意义，并在稻瘟病的防治上具有重要的流行学和防治学意义。本文结合浙江省农业科学院植微所真菌病害研究室承担的浙江省基金和国家攻关项目，开展了梨孢菌的亲缘关系分析，为这些真菌的系统分类学研究开展一些基础性工作。

1 材料与方法

1.1 供试梨孢菌菌株

供试菌株由浙江省农业科学院植微所真菌病害研究室收集和提供，参试菌株梨孢菌(Pyricularia)是一类重要的植物病原菌，共计49个菌株，这些菌株的寄主植物及来源见表1。先将稻节保存的菌株转移到斜面淀粉酵母培养基上，待菌体活化后，再将斜面培养基上菌丝块转移到装有50 mL Vogel’s液体培养基(培养基配方见参考文献3)的100 mL三角瓶中，在摇床上(24 ℃，100 r/min)振荡培养3～4 d，待液体培养基中的菌丝球长得较丰富时，利用真空泵将菌丝体抽滤到滤纸上，菌丝体用无菌水冲洗2遍，控干水分后将菌丝体转入5 mL的离心管中，保存于-20 ℃冰箱，待用。

表1 参试梨孢菌的寄主植物及菌株来源Table 1 The host plants and collection spots of Pyricularia

1.2 梨孢菌DNA提取和随机扩增多态性DNA(RAPD)分析

梨孢菌总DNA提取按参考文献4方法进行。 梨孢菌RAPD扩增采用MJ梯度PCR仪，反应所需的dNTP、Taq酶、PCR缓冲液和随机引物均由上海生物工程公司提供。共测试了12条随机引物(S343、S346、S350、S359、S361、S363、S365、S367、S374、S377、S378、S380)。 PCR反应体系为25 μL，其中dNTP 2 μL，Taq酶0.2 μL (一个单位)，10倍的PCR缓冲液2.5 μL，随机引物1 μL，模板(样品)DNA，水18.3 1 μL 。PCR扩增程序为：(1)94 ℃预变性 1 min；(2)94 ℃ 15 s；(3)36 ℃ 30 s；(4)72 ℃ 30 s；(5)从(2)至(4)循环44次；(6) 72 ℃ 下放置5 min；(7)移出后放入4 ℃冰箱中保存。

1.3 RAPD扩增产物的电泳和谱带分析

在RAPD的扩增产物中各加入5 μL 的0.4%的溴酚蓝(含40%蔗糖)混匀，然后进行琼脂糖凝胶(1.5%)电泳，点样量为12 μL，电泳时的电压大槽为120 V，小槽为80 V。电泳结束后，凝胶在EB染色液中染色30 min，然后将凝胶置于紫外透射仪中进行谱带观察，并进行照相。对各样品出现的谱带用DPS分析软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 梨孢菌的RAPD电泳谱带差异及亲缘关系分析

利用12个随机引物对梨孢菌进行DNA的RAPD扩增，其中引物S380对梨孢菌 的RAPD扩增产物的多态性最丰富(图1)。从DNA电泳谱带中可以直观地看出，来自同一种或同一属或亲缘关系相近寄主上的梨孢菌带型较相似，相反，亲缘关系较远的寄主上的梨孢菌带型谱带差异较大，茭白、碎米莎草和马唐寄主上的梨孢菌的谱带均非常特异，与牛筋草和狗尾草等其他15种寄主的梨孢菌有较大差异，牛筋草和狗尾草等15种寄主的梨孢菌存在比较多的共有谱带。

对引物S380扩增的RAPD谱带进行聚类分析(欧氏距离，离差平方和法，图2)。结果表明，18种寄主上的49个梨孢菌株可分为5个类群，各类菌株的类内谱带相似性均在50%以上。来自燕麦、茼草、稗、雀麦、双穗臂形草、臂形草、象草、罗氏草和铺地黍的19个菌株为一个类群；牛筋草、龙爪稷、狗尾草、粟寄主上的15个菌株也为一个类群；来自马唐的11个菌株为一个类群；茭白和碎米莎草寄主上的梨孢菌的谱带均非常特异，各为一个类型。

3 讨论

从随机扩增多态性DNA(RAPD)电泳谱带对梨孢菌的亲缘关系分析结果可以看出，来自同一种或同一属或亲缘关系相近寄主上的梨孢菌带型较相似，相反，亲缘关系较远的寄主上的梨孢菌带型谱带差异较大，茭白、碎米莎草和马唐寄主上的梨孢菌的谱带均非常特异，与牛筋草和狗尾草等其他15种寄主的梨孢菌有较大差异，牛筋草和狗尾草等15种寄主的梨孢菌存在比较多的共有谱带。研究结果也表明真菌种间或专化型之间的DNA( RAPD谱带)电泳谱带差异明显，而种内生理小种间的带型差异较小。

DNA分子标记已广泛应用于真菌的种和专化型分类及亲缘关系分析、寄主抗病基因和病菌致病基因的分子标记、病菌生理小种和致病型的区分、真菌或病原菌的遗传变异和遗传多样性等方面的研究[5-8]。利用DNA分子标记进行真菌的种和专化型(病菌对寄主种的专化性)分类已有许多报道，该技术已比较成熟。但利用DNA分子标记区分病菌生理小种(病菌对寄主品种的专化性)和致病型的技术还不够成熟，虽然也有一些利用分子标记区分病菌生理小种和致病型报道，但也出现了一些相反的报道，这方面的研究有待进一步的完善。

[1]Leung H，Borromeo E S，Bermardo M A，et al. Genetic analysis of virulence in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J]. Phytopathology，1998，78：1227-1233.

[2]Borromeo E S，Nelson R J，Bonman J M，et al. Genetic differentiation among isolates ofPyriculariainfecting rice and weed hosts[J]. Phytopathology，1993，83(4)：393-399.

[3]Vogel H J. A convenient growth medium for Neurospora (medium N)[J]. Microbial Genetics Bulletin，1956，3：42-43.

[4]任衍春，张震，毛雪琴，等. 水稻纹枯菌总DNA提取方法的比较[J]. 浙江农业学报，2011，23(4)：741-747.

[5]周永力，吕国忠，刘伟成，等. 采用PCR-RFLP和RAPD对球壳孢目真菌系统学的研究[J]. 菌物系统，1998，7(2)：160-166.

[6]Ellis M B. More dematicious hyphomycetes[M]. CMI，Kew，1976：170-174，186-189.

[7]Gang D R，Webe D J. 利用逢机增殖DNA片段来分析3种小麦黑穗病菌遗传变异[J]. 植物学汇刊，1996，37(3)：173-180.

[8]Rossman A Y，Howard Rn J，Vslent B. Pyricularia grisea，the correct name for the rice blast disease fungus[J]. Mycologia，1990，82(4)：509-512.

SuddyonPhylogeneticRelationshipofPyriculariasp.StrainsIsolatedfromDifferentHostWeedsinRiceField

MAO Xue-qin, QIU Hai-ping, ZHANG Zhen, JIANG Hua, CHAI Rong-yao, WANG Jiao-yu,WANG Yan-li, SUN Guo-chang, DU Xin-fa

(State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control，Institute of PlantProtection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China)

By using Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD) weeds in rice field mark derived from 12 primers,the phylogenetic relationship of 49Pyriculariasp. strains isolated from 18 host were analyzed. The electrophoresis bands of DNA visually showed that belt type ofPyriculariasp. strains derived from the same species,same genera or closely related host was similar. In contrast,belt type ofPyriculariasp. strains derived from distantly related host was quite different.Pyriculariasp. strains belts type derived fromZizanialatifolia,CyperusiriaandDigitariasanguinaliswere very special,and quite different from that of the other 15 hosts includingEleusineindica,Setariaviridis,etc.,presenting more common electrophoresis bands. The results of cluster analysis based on RAPD band using primer S380 showed that 49Pyriculariasp. strains derived from 18 hosts could be divided into 5 types.Quite different RAPD bands existed in inter-species，but little different RAPD bands existed in deferent varieties involved in the same species.

Pyriculariasp.;random amplified polymorphic DNA(RAPD);cluster analysis

S451

A

1003-935X(2012)04-0026-04

2012-11-08

国家自然科学基金(编号：30900933、30970082、31170136)；浙江省自然科学基金(编号：Y3110537)；浙江省重大科技攻关专项(“9410”计划、“8812”计划)。

毛雪琴(1976—)，女，浙江龙泉人，助理研究员，主要从事植物病原真菌研究。Tel：(0571)86419061；E-mail：lqmxq155@163.com。

杜新法，副研究员，主要从事植物病原真菌研究。E-mail：duxinfa@yahoo.com.cn。