吡格列酮和高脂喂养对SD大鼠SIRT6表达的影响

章建梅 徐 淼 韩俊峰 陆俊茜 刘若冰 魏 丽 贾伟平

SIRT6由Fyre1999年发现，是一种在哺乳动物的多个组织中广泛表达的细胞因子，为组蛋白H3K9去乙酰化酶和ADP－核糖基转移酶，具有抗衰老、抑制炎症等作用［1～4］。新近的研究发现其与糖脂代谢密切相关，而对其的调控研究却知之甚少。关于糖脂代谢异常是否会引起SIRT6表达的改变及治疗糖脂代谢异常的药物又是否影响SIRT6目前研究较少。本研究拟通过高脂喂养建立肥胖SD大鼠模型并用吡格列酮干预来观察SIRT6表达的改变，观察高脂和PPAR－γ激动剂对SIRT6表达的影响，为深入了解SIRT6的调控机制提供依据。

材料与方法

1．动物模型的建立及分组:8周龄、体重约200g雄性清洁级SD大鼠(上海西普尔－必凯实验动物有限公司)24只适应性喂养1周后随机分为:普通对照组(NC)8只，高脂组16只。每周记录体重、摄食量和饮水量。NC组给予普通饲料，高脂组给予高脂饲料。普通饲料总热量为380kJ/100g，其中糖类占55%，脂肪占24%，蛋白质占21%。高脂饲料总热量为520kJ/100g，其中糖类占20%，脂肪占59%，蛋白质占21%。高脂组喂养8周后，再随机分为两组:高脂饮食组(HF)和吡格列酮(日本武田公司)治疗组(FP)，每组8只。FP组予吡格列酮20mg/(kg·d)灌胃，NC组和HF组相应予溶剂灌胃，灌胃 4 周［5］。

2．标本收集及处理:12周后处死大鼠，死前静脉采血，收集血清，－80℃保存待测。摘取附睾周围脂肪、肝脏以及肌肉组织，－80℃保存备用。

3．大鼠血脂、血糖的测定:大鼠禁食12h后空腹血糖由强生血糖仪测尾尖血两次取平均值获得，空腹胰岛素采用酶联免疫法(mercodia公司)。Glamour 2000全自动检测分析仪测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)。

4．RT－PCR:Trizol(Invitrogen公司)法提取总 RNA，反转录为cDNA(Epicentre公司反转录试剂盒)。根据SIRT6和管家基因18S的基因序列，设定上、下游引物。SIRT6:上游引物5'－gccgtctggtcattgtca－3'，下游引物 5'－agccttgggtgctactgg－3'(191bp);18S:上游引物 5'－ gtaacccgttgaaccccatt－3'，下游引物5'－ccatccaatcggtagtagcg－3'(151bp)。SIRT6的反应条件:95℃预变性 5min，95℃ 变性 30s，56℃ 退火 30s，72℃ 延伸40s，30个循环，72℃延伸10min。18S的反应条件:95℃预变性 5min，95℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 40s，30 个循环，72℃ 延伸10min。PCR产物经电泳分析鉴定，凝胶成像后结果应用灰度扫描仪分析SIRT6与对应的18S条带灰度的比值表示SIRT6的相对表达量。

5．Western blot:用RIPA裂解液提取组织蛋白，取80μg蛋白质样品上样，电泳及转膜。膜与SIRT6抗体(abcam公司)1∶1000、β －actin 抗体1∶800、ERK 抗体1∶1000，4℃过夜。Ⅱ抗(1∶2500)室温下与膜进行杂交1h。ECL显色，摄取图像。应用灰度扫描仪分析SIRT6与对应的β－actin/erk条带灰度的比值表示其相对表达量。

6．统计学方法:应用SPSS 16．0统计软件，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用配对t检验及单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．各组大鼠体脂和血脂谱差异:12周后，HF组大鼠体重、FINS、FBG、TC、TG 和 LDL－C 均明显高于NC组(P均＜0.05)，HDL－C较NC组明显下降(P＜0.01)。与HF组相比，FP组大鼠体重、FINS、FBG、TC、TG、LDL－C均下降，差异有显著性(P均＜0.05，表1)。

2．高脂和吡格列酮对SIRT6表达的影响:SIRT6在大鼠附睾脂肪、肝脏及肌肉组织均有表达。与NC组相比，HF组大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白及mRNA轻度下降。而吡格列酮治疗后，大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA与HF组相比分别上升1．51倍、2．07倍、1．72倍(P ＜0．05);大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白与HF组相比分别上升1．44倍、1．89倍、1．33倍(P ＜0．05，图1、图2)。

表1 各组间大鼠体重和血生化指标的比较(x±s)

讨 论

肥胖是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态，肥胖者的细胞肥大且数量增多，可导致某些激素的表达增强或减弱，从不同层次影响糖脂代谢，形成糖脂代谢紊乱。SIRT6是一种由355个氨基酸残基组成的核蛋白，基因定位于19p13．3，它跨越了8427bp的区域，由8个外显子和7个内含子组成［1］。Mostoslavsky等［2］发现 SIRT6 基因缺陷小鼠产后四周表现为皮下脂肪减少、低血IGF－1及致死性血糖。Zhong等［3］的研究发现，SIRT6敲除使得糖酵解关键酶启动子上组蛋白乙酰化，使DNA与组蛋白结合松弛，从而促进这些酶转录活性增加，使血糖进入外周组织细胞参与糖酵解，引起血糖降低。Kim等［4］观察到，肝脏特异性SIRT6敲除的小鼠脂肪合成增加而氧化减少，最终小鼠发展为脂肪肝。另一方面Kanfi等［5］也发现过表达SIRT6可抑制高脂饮食引起的肥胖，提示SIRT6参与糖脂代谢的调节。目前对SIRT6的表达调控方面的研究较少。我们知道SIRT6对糖脂代谢有着重要的作用，而吡格列酮是治疗糖脂代谢异常的常用药物。吡格列酮为PPAR－γ激动剂，通过激动PPAR－γ对许多基因起着调控作用。因此我们观察了高脂和PPAR－γ对SIRT6表达的影响。

本研究发现高脂饲喂后大鼠的体重、FINS、FBG、TC、TG和LDL－C均明显升高(P ＜0．05)，HDL－C则明显下降，而吡格列酮干预后大鼠的体重、FINS、FBG、TC、TG和LDL－C均下降，差异有显著性(P＜0．05)。提示吡格列酮除具有明显降糖作用外，还具有明显的调脂作用。

研究显示热量限制或禁食后SIRT6表达明显升高，但高脂对SIRT6表达的影响尚有争议:如有研究显示高脂饮食大鼠SIRT6蛋白轻度降低;而Palmer等［6］却发现高脂饮食小鼠SIRT6蛋白明显下降(P＜0．05)。本研究发现高脂喂养后，虽然大鼠附睾脂肪、肝脏及肌肉组织中SIRT6蛋白和mRNA表达有所下降，但没有显著性差异，推测高脂对SIRT6的影响可能存在种属间差异。

我们的实验结果显示PPAR－γ可以上调大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA和蛋白的表达。PPAR－γ激动剂吡格列酮治疗后，大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA与HF组相比分别上升1.51倍、2.07倍、1.72倍(P＜0.05)。而大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白与 HF组相比分别上升1．44倍、1．89倍、1．33倍(P＜0．05)。本实验发现吡格列酮可从mRNA及蛋白水平影响SIRT6的表达，推测吡格列酮的降糖、调脂作用可能经由上调SIRT6的表达来起作用的。本实验结果还发现吡格列酮治疗后肝脏组织SIRT6 mRNA及蛋白上升最显著，推测吡格列酮主要上调肝脏SIRT6影响肝脏糖脂代谢从而起着降糖调脂的作用。Yang等［7］的实验也显示罗格列酮可改善肝纤维化，促进OLETF小鼠肝脏SIRT6表达，本实验结果与其一致。Kim等［4］的实验结果也提示肝脏特异性SIRT6敲除的小鼠最终小鼠发展为脂肪肝。

总之，本研究通过对高脂喂养及吡格列酮干预后大鼠各组织SIRT6表达水平的观察，发现高脂喂养降低SIRT6的表达，而吡格列酮治疗后可逆转SIRT6的表达，且血糖血脂明显改善，推测吡格列酮通过激动PPARγ上调 SIRT6的表达从而影响糖脂代谢，但PPARγ对SIRT6的具体调控机制还有待细胞水平的进一步分析。

1 Frye RA．Phylogenetic classification of prokaryotic and eukaryotic Sir2－ like proteins［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，273(2):793－798

2 Mostoslavsky R，Chua KF，Lombard DB，et al．Genomic instability and aging － like phenotype in the absence of mammalian SIRT6［J］．Cell，2006，124(2):315－329

3 Zhong L，D'Urso A，Toiber D，et al．The histone deacetylase Sirt6 regulates glucose homeostasis via Hif1alpha［J］．Cell，2010，140(2):280－293

4 Kim HS，Xiao C，Wang RH，et al．Hepatic－ specific disruption of SIRT6 inmice results in fatty liver formation due to enhanced glycolysis and triglyceride synthesis［J］．Cell Metab，2010，12(3):224 －236

5 Kanfi Y，Peshti V，Gil R，et al．SIRT6 protects against pathological damage caused by diet－ induced obesity［J］．Aging Cell，2010，9(2):162－173

6 Palmer NO，Fullston T，Mitchell M，et al．SIRT6 inmouse spermatogenesis ismodulated by diet－ induced obesity［J］．Reprod Fertil Dev，2011，23(7):929－939

7 Yang SJ，Choi JM，Chae SW，etal．Activation of peroxisome proliferator－activated receptor gamma by rosiglitazone increases sirt6 expression and ameliorates hepatic steatosis in rats［J］．PLoSOne，2011，6(2):e17057