内质网应激与相关肺疾病

高楚楚 卢红艳

内质网应激是细胞的一种重要自我防御机制，而强烈持久的内质网应激可导致细胞凋亡。肺泡Ⅱ型上皮细胞含有丰富的内质网，具有发生内质网应激的条件和基础，许多肺部疾病如间质性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、高氧肺损伤等的发生均与内质网应激有关。内质网应激可能是研究肺部疾病发病机制和防治措施的新靶点。

一、内质网应激概述

内质网是分泌性蛋白折叠、修饰和钙贮存的主要场所，它在维持细胞稳态中起关键作用。多种因素如氧化应激、热休克、缺血、感染等作用于细胞后均可引起内质网的内稳态失衡，导致蛋白加工/运输障碍以及钙离子摄取/释放障碍，从而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS主要激活细胞内3条信号通路:即未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)、折叠蛋白超负荷反应和固醇调节级联反应。其中UPR是目前研究最为深入的ERS激活通路。哺乳动物细胞内有3种感受ERS的UPR信号元件，分别是PKR样ER调节激酶(PERK)、Ⅰ型内质网跨膜蛋白激酶(IRE1)及活化转录因子6(ATF6)。在非应激状态，内质网内的伴侣分子GRP78/Bip与 3者结合封闭其信号;应激时，GRP78/Bip从3种感受器元件上解离并与错折叠蛋白结合阻止其输出，导致3种感受器游离激活启动UPR。PERK激活使真核细胞翻译起始因子2(eIF2α)磷酸化失活，使之无法进行翻译起始，从而抑制大多数蛋白质的翻译生成，阻止新生蛋白持续进入内质网。另一方面，磷酸化eIF2α可增加ATF4转录合成，ERS过度激活时，ATF4高表达将导致凋亡信号分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer－binding protein homologous protein，CHOP)表达上调，诱导细胞凋亡。IRE1活化后剪切X盒结合蛋白1(XBP1)前体mRNA使之翻译出活性XBP1，进而激活内质网应激反应元件(ER strss response element，ERSE)，上调分子伴侣转录水平，促进蛋白质正确折叠，同时促进未折叠蛋白转运至胞质内进行内质网相关蛋白降解过程［1］。IRE1通路过度激活同样能引起细胞凋亡，一方面，通过TRAF2－ASK1－JNK途径激活JNK，诱导细胞凋亡;另一方面，直接或间接激活凋亡因子caspase－12，并进一步级联激活caspase－9及 caspase－3，从而诱导细胞凋亡［2］。ATF6 与GRP78/Bip解离后转移至高尔基体，被鞘氨醇－1－磷酸(S1P)和鞘氨醇－2－磷酸(S2P)切割激活后进入细胞核启动ERSE基因表达。此外，ATF6还能与IRE－1共同作用诱导XBP1mRNA的增加，共同增强蛋白质折叠和相关蛋白降解能力［3］。ATF6过表达亦会诱导CHOP大量转录激活，引起细胞凋亡。

二、肺泡上皮细胞ERS的生物学效应

1．ERS与肺泡上皮细胞凋亡:肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AECs)的一个重要特征就是富含高度发达的内质网，以合成分泌大量肺泡表面活性蛋白(surfactant proteins，SPs)，对 ERS极为敏感。众多研究表明，ERS过强过久，可通过激活下游相关信号转导通路，导致AECS发生凋亡。应激条件下，内质网内Ca2+向胞质释放，激活钙蛋白酶，进而活化caspase家族，产生caspase级链反应。caspase－3是执行凋亡过程的最终效应子，它的活化可直接导致细胞凋亡发生，因此caspase－3的激活可作为鉴别AECs凋亡发生的一个重要标志。Xu等［4］发现，新生鼠高氧暴露后，AECs中BiP/GRP78和caspase－3表达显著升高，提示ERS参与并介导AECs凋亡。ERS时，ATF4高表达可导致CHOP表达上调，而高表达的CHOP可通过下调抗凋亡基因Bcl－2的表达，减少细胞内谷胱甘肽量及增加活性氧产物而阻滞细胞分裂周期诱导细胞凋亡。Mulugeta等［5，6］研究发现，BiP/GRP78、ATF－4、CHOP等 ERS相关信号蛋白表达增高，参与AECs凋亡发生过程，同时认为caspase－4(人类的caspase－4和啮齿类动物的caspase－12同源性最高)起了中介信号的作用激活caspase－3，最终诱导细胞凋亡。另外，JNK通过活化Bim(Bcl－2家族中的促凋亡因子)，抑制抗凋亡蛋白Bcl－2，从而介导线粒体途径的细胞凋亡。胡兰等［7］在高氧诱导的肺应激性损伤研究中发现，JNK信号转导通路参与了高氧下AECs凋亡的信号转导，发挥促细胞凋亡效应;阻断或抑制JNK信号通路，可改善肺组织病理损伤，减少AECs凋亡。

2．ERS与肺泡上皮细胞上皮－间质转化:上皮细胞—间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是指完全分化的上皮细胞通过细胞表型改变从而转化成完全分化的间质细胞的过程，通常转化为成纤维细胞与肌纤维母细胞［8］。哺乳动物AECs主要由肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)和肺泡AECⅡ型上皮细胞(AECⅡ)组成，共同维持细胞的正常结构。其中AECⅡ是肺内主要干细胞，生理条件下，既可通过有丝分裂自我更新，也可转分化为AECⅠ参与肺损伤后的早期修复过程;慢性肺损伤时，在致病因素持续作用下，AECⅡ不断增殖并且向AECI转分化失去调控，进而引起细胞过度增殖肥大，产生细胞因子、炎症趋化因子、细胞黏附分子等，与此同时，该过程也可伴随脂成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化，进一步诱导形成肺纤维化［9］。AECⅡ具有惊人的表型可塑性，在某些特定条件下(例如:损伤)，AECⅡ向AECⅠ转化受抑，AECⅡ也可通过EMT过程转变成成纤维细胞和肌纤维母细胞［10］。

目前，对于肺泡上皮细胞－间质转化的机制尚未明确。有实验发现TGF－β1能在体外诱导AECs向间质细胞转变，其机制部分与Smad信号转导途径相关［11］。近来，Tanjore等［12］用衣霉素和变异的 SP －C诱导AECs发生ERS，显示上皮细胞标志物E钙黏蛋白、ZO－1等表达量降低，而间质标志物α平滑肌肌动蛋白(α－SMA)等表达量升高，同时通过siRNA转染使Smad2与 Src激酶基因沉默抑制 EMT，发现AECs保留其上皮表型及上皮细胞标志，认为Smad和Src激酶可能是介导ERS时EMT的信号蛋白。Zong等［13］用肺上皮 A549细胞转染突变体 SPCΔexon4诱导肺纤维化模型，发现ERS标志物GPP78表达升高，也发现类似的EMT标志物表达量变化，认为ERS诱导了AECs发生 EMT，并提示肺纤维化时，ERS对成纤维细胞增多起重要作用，且至少有Src依赖的信号途径参与了该过程。

3．ERS与肺泡上皮细胞前炎症信号:越来越多的证据表明ERS与炎症反应存在密切联系，目前认为其分子基础主要涉及两种机制，即核转录因子NF－κB和活化细胞内蛋白激酶JNK的激活。ERS时，活化的IRE1可募集肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)形成IRE1－TRAF2复合体，一方面可进一步结合并激活JNK，进而磷酸化激活转录因子激活蛋白1(activator protein 1，AP1)，诱导前炎症因子的基因表达［14］;另一方面可招募IκB并使其降解释放出NF－κB，NF－κB离开膜表面进入细胞核内直接调控细胞活动，可诱导 TNF－α等炎性介质释放［15］。PERK通路激活也可导致NF－κB的活化，由于IκB的半衰期显著小于 NF－κB，ERS活化的 PERK－eIF2α介导的翻译抑制作用增加了NF－κB/IκB的比值，释放了“多余”的NF－κB入核，从而启动前炎症因子的基因转录［16］。内质网蛋白质折叠负荷超过自身处理能力时，发生ERS引起UPR，由各信号通路直接启动炎症反应。Maguire等发现，通过肺上皮A549细胞转染SP－C突变体可引起多种UPR相关基因表达上调，活化JNK/AP－1信号，并增加IL－8等前炎症细胞因子的分泌，说明SP－C突变后错折叠可诱导ERS促进上皮细胞前炎症信号。

三、ERS相关肺疾病

1．间质性肺疾病:间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是一组表现为不同程度的肺泡炎和间质发生纤维化病变的肺功能紊乱疾病，包括特发性肺纤维化(IPF)、间质性肺炎等。研究提示ERS可能在肺纤维化时肺组织上皮修复机制中起关键作用。Horowitz等发现，IPF患者肺匀浆和AECs中的ERS介导者ATF－6、ATF－4等以及凋亡介导者CHOP的蛋白水平、活化的XBP－1转录水平明显增高，并在肺中检测到CHOP下游的应激关键促凋亡分子Bax低聚物和应激凋亡标志物caspase－3的活性剪切体的存在。因此，在散发的IPF患者的AECⅡ中，严重的ERS反应可能是该细胞类型发生凋亡和纤维化的基础。进一步研究提示SP－B和SP－C缺陷与ILD的发生发展关系密切，儿童及成人ILD患者的发病多数与SP－C编码基因发生突变有关，SP－CΔexon4点突变进而引起SP－C错折叠蛋白蓄积于内质网可启动ERS级联反应，激活 UPR，同时应激凋亡标志物caspase－12和caspase－4表达增加。

2．慢性阻塞性肺疾病:慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)的发病机制尚未明确，目前公认吸烟是COPD最重要的致病因素。ERS诱导AECs凋亡机制可能参与了COPD发病的病理生理过程。香烟烟雾中的氧化性物质可引起肺细胞发生ERS，过度ERS则诱导肺细胞发生凋亡，从而促进COPD的发生发展。Kelsen等通过蛋白质组学研究发现慢性吸烟者肺内GRP78、钙网织蛋白、蛋白质二硫键异构酶等ERS及UPR相关标志蛋白表达上调，提示COPD患者肺内确实存在ERS。Tagawa等发现吸烟可引起小鼠肺内Bip和CHOP表达上调，认为存在ERS相关细胞凋亡。在吸烟诱导的COPD大鼠模型，肺泡上皮细胞内质网应激相关蛋白GRP78及凋亡基因caspase－12表达增加，提示吸烟诱导的COPD中，肺泡上皮细胞发生了内质网应激诱导性凋亡。这些结果提示ERS确实能影响COPD的发生发展。

3．肺癌:ERS可能在肺癌发生发展过程中起关键作用，Kim等发现ERS标志蛋白GRP78、CHOP和自体吞噬蛋白Beclin－1在肺癌中的激活现象与临床病理因素以及患者存活情况有关，鉴于GRP78、CHOP和Beclin－1可能在肺部肿瘤发生发展过程中起重要作用，认为这些蛋白可成为非小细胞型肺癌患者病情转归的一项新预后指标。Dehydrocostuslactone(DHE)是一种倍半萜烯内酯，它可通过ERS介导的细胞凋亡对非小细胞型肺癌发挥抑制作用，这主要依赖DHE作用后可引起一系列ERS标志物的上调，包括胞质钙水平的上调、IRE－1及CHOP/GADD153的增高、PERK的磷酸化、XBP－1 mRNA的拼接、caspase－4的激活等。对人肺癌A549细胞的研究证实asterosaponin 1同样可使ERS经典标志物表达上调，包括 GRP78、GRP94、CHOP、caspase－4 和 JNK等，进而介导肿瘤细胞发生凋亡，这为肺癌治疗提供新思路和相关依据。

4．高氧肺损伤:长期吸入高浓度氧可引起急慢性肺损伤，研究发现，氧化应激过程中产生的大量ROS是引起内质网中蛋白质错折叠和ERS诱发凋亡的一个重要原因，提示持续性高氧暴露引起的氧化应激可导致ERS，导致肺损伤。肺损伤包括肺泡结构破坏、通透性增高及纤维化病变，由于AECⅡ是肺损伤时的关键修复细胞，ERS介导的AECⅡ存活及凋亡变化可能参与高氧肺损伤的发展和转归。Jennifer等发现高氧导致ERS引起细胞凋亡并不依赖于BiP，但能够使细胞对错折叠蛋白的毒性敏感，并产生大量ROS，该过程可增强UPR，说明高氧在肺疾病治疗中引起肺损伤的过程可能与ERS相关。虽然诸多实验表明高氧并不激活UPR感受器IRE1、PERK、ATF6，但肺损伤的发生与ERS诱导细胞凋亡通路密切相关。Xu等研究发现ERp57的过表达促进AECs凋亡，而敲除ERp57则可通过抑制caspase－3通路及上调BiP/GRP78表达从而减少高氧暴露引起的细胞凋亡。有研究发现在高氧诱导的肺损伤中，JNK信号转导通路被激活，并参与了高氧下AECⅡ凋亡的信号转导，发挥促炎症和细胞凋亡效应;阻断或抑制JNK信号通路，可减少高氧暴露下肺组织的炎性渗出及AECⅡ凋亡，对高氧肺损伤可能起保护作用［7］。支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是发生于早产儿长期应用高浓度氧和机械通气后的一种以肺部出现炎症和纤维化为主要特征的慢性肺损伤疾病，因此阐明ERS与高氧肺损伤的关系，可能对防治BPD发生具有重要指导意义。

四、ERS与肺部疾病治疗

由于ERS参与了一系列肺部相关疾病的发生发展过程，以ERS为靶向的药物研发具有广阔的应用前景。通过药物如牛磺酸、丹芍化纤胶囊等下调ERS发生标志物如GRP78、XBP－1、ATF4及ERS相关凋亡蛋白家族成员CHOP、JNK、Bcl－2等基因的表达，可减轻ERS反应并调控细胞凋亡，抑制肺部炎症及肺纤维化，减轻肺损伤。干扰UPR激活或改变内质网伴侣蛋白GRP78/Bip表达水平，可阻遏在体肿瘤生长，为肺癌的治疗提供新思路，例如asterosaponin 1可通过上调ERS标志分子GRP78、CHOP、caspase－4和JNK的表达从而发挥对肺癌A549细胞增殖的抑制作用，提示其可能会成为治疗肺癌的一种新型药物。另外，ERS的发生与错折叠蛋白的聚集密切相关，暗示通过合理应用蛋白酶体激动剂有利于促进AECs内错折叠蛋白SP－C的降解，减少其分泌合成，有可能成为治疗肺部疾病的一个潜在途径。

五、展 望

随着实验的深入，ERS与阿尔茨海默病、糖尿病、心血管疾病等发病机制的关系已日渐明朗，但现今对ERS参与肺部疾病病理生理过程的研究仍非常少。目前认为，ERS作为一把双刃剑，可介导AECs的适应性存活与凋亡，对肺部疾病的发生发展起重要作用，但其具体机制尚未阐明，这些空白将吸引更多的科研人员致力于该领域的研究，为相关肺疾病的临床治疗提供科学依据。如探讨SP－C异常与ERS发生的关系，研究SP－C突变后错折叠对AECs增殖、分化及凋亡的影响，并从UPR及影响UPS活性角度阐明其损伤机制，都将进一步深化对相关肺疾病发病分子机制的认识并为其治疗提供明确的分子靶标。

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