环孢菌素A－纳米乳促进猪脂肪组织来源干细胞的增殖

尹巧香 王 恒 裴志勇 赵玉生

环孢菌素A(cyclosporine A，CsA)是临床广泛应用的高效免疫抑制剂，主要用于脏器移植术后抗免疫排斥反应和免疫疾病的治疗。最近，系列研究认为CsA能促进心脏祖细胞分化为心肌细胞，其促增殖作用使心肌细胞产量提高了数倍甚至数十倍。还有一些研究认为CsA能促进人类成纤维细胞、血管内皮细胞增殖［1～3］。基础研究的结果令人鼓舞，无疑为心脏再生提供了可能使用的一种药物治疗。然而，CsA的治疗可引起很多不良反应，包括肝肾功能损害，牙龈过度增殖等，毫无疑问又限制了CsA现阶段在临床的大规模使用。为此，我们借鉴肿瘤化疗药物纳米制剂靶向递药的成功经验，制备出负载环孢菌素A的纳米乳(cyclosporine A－nanopaticals emulsion，CsA －NP)，由于通过修饰纳米微粒的直径和表面特性可控制药物在体内的重新分布，因而可达到靶向、高效、低毒的独特药理作用。脂肪组织来源干细胞(adipose tissue－derived stem cells，ASCs)因其来源广泛，取材方便，易于培养扩增，无伦理学困扰等优势，而成为目前最具有吸引力的干细胞来源之一［4］。

本项研究提取小型猪的腹股沟脂肪组织，诱导分离为原代ASCs，并传代扩增后进行鉴定。同时明确CsA －NP能否促进ASCs增殖，提高ASCs产量和效能，为后续在体动物研究药物的应用提供依据。

材料与方法

1．实验动物:广西巴马小型猪，雌雄不限，4～6个月龄，体重20～30kg，购自东北农业大学－中国农科院哈尔滨分院，由解放军总医院动物中心饲养。所有动物研究全部符合国家《实验动物管理条例》和《北京市实验动物管理条例细则》。实验经解放军总医院动物中心登记、许可。

2．小型猪脂肪组织来源干细胞的提取、培养及鉴定:小型猪麻醉后，取腹股沟皮下脂肪组织5～8g，冲洗、去除血污和组织碎片，剪碎至糊状，加入终浓度为0．1%的消化液20ml［1%Ⅰ胶原蛋白酶1．5ml(Gibco公司，美国)+1%Dispase酶1.5ml+0．25%胰酶6ml+无血清 L－DMEM培养液11m l］。置于37℃水浴震荡消化1h，然后加入等量的含10%胎牛血清(10%FBSGibco公司，美国)的L－DMEM培养基终止消化。过滤;水平离心机800r/min离心5min;加入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/m l链霉素的L－DMEM培养基重悬细胞;置入37℃、饱和湿度5%CO2培养箱中培养。24h后换液去除未贴壁细胞。此后2～3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态，至细胞达到80% ～90%融合时传代。传代时，加入0．25% 胰蛋白酶和0．02%EDTA 2m l，倒置相差显微镜见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后立即加入2ml含10%FBS低糖 －DMEM培养液中止消化;1000r/min离心10min，弃上清液后加入少量含10%FBS低糖－DMEM培养液重悬，以1传3的比例接种于新的培养皿内。待细胞达到近融合状态时便可再次传代。

3．小型猪脂肪组织来源干细胞的鉴定:取生长状态良好的第3～4代细胞，用0．25%胰蛋白酶溶液消化后离心，沉淀重悬于PBS中，细胞密度调整为1×106m l。分别加入以下抗体:CD29 － FITC、CD31 － PE、CD34、CD44 － FITC、CD45、CD90－FITC、CD105－FITC和 HLA－DR－FITC。对照管加入PBS，CD34、CD45两个管加入相应的FITC二抗，流式细胞仪检测，记录标本的阳性细胞百分率。Cell Quest软件进行数据分析。

4．CsA－NP对ASCs增殖的影响:取生长状态良好的第3～4代细胞，用0．25%胰蛋白酶溶液消化后计数，按细胞密度为1．2×104ml接种于96孔培养板中，每板均分为7组，分组如下所示。其中0组作为空白对照组，每组均重复5孔，每组加100μl细胞悬液，实验组外周1圈加入100μl的 PBS，于37℃，饱和湿度5%的CO2培养箱中培养24h，弃上清，分别加入含 0、0．01、0．1、0．5、1、5μmol/L CsA － NP(由军事医学科学院药物与毒物研究所制备、鉴定)的培养基(含10%FBS)200μl，继续孵育1～7天，且每个时间点均设立对照组。于培养终止前4h，每孔加入MTT液(5mg/ml，美国 Sigma公司)20μl，置于37℃ 、5%的CO2培养箱继续孵育4h后，酶标仪测定各孔OD450值。各组OD450值分别减去空白对照组OD450值作为纵坐标，以时间(h)为横坐标，绘制生长曲线。

0组:L－DMEM+10%FBS;1组:L－DMEM+10%FBS+ASCs;2组:L－DMEM+10%FBS+ASCs+0．01μmol/L CsA －NP;3组:L －DMEM+10%FBS+ASCs+0．1μmol/L CsA －NP;4组:L －DMEM+10%FBS+ASCs+0．5μmol/L CsA －NP;5组:L－DMEM+10%FBS+ASCs+1μmol/L CsA －NP;6组:L－DMEM+10%FBS+ASCs+5μmol/L CsA－NP。

5．统计学方法:所有数据应用SPSS 17．0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．脂肪组织来源干细胞(ASCs)形态的观察:ASCs原代细胞接种24h内贴壁，其中混有大量不贴壁的红细胞及脂肪油滴，24h后首次换液，去除绝大部分不贴壁细胞(图1A);原代细胞1周可达80%融合，继续1∶3传代培养。传代后细胞生长迅速，5天左右可达单层细胞融合80% ～90%，传代后细胞呈长梭形，纤维细胞样形态，核居中，有1～2个核仁，细胞融合80% ～90%后可继续多次传代，形态变化不大，见图1B。第3代传代细胞呈旋涡状生长(图1B)。

图1 脂肪组织来源干细胞

2．流式细胞仪检测ASCs表面标志物:经流式细胞仪检测(图2)，其结果如下:CD29(99．06±0.30)%、CD44(98．20 ±0．30)%、CD90(97．40 ±0．40)%、CD105(98．30 ±0．44)%、CD31(2．06 ±0．06)%、CD34(2．34 ±0．33)%、CD45(1．98 ± 0．08)%、HLA － DR(1．66 ±0.08)%。检测结果提示 ASCs分子表型 CD29、CD44、CD90、CD105 均呈阳性表达，而 CD31、CD34、CD45、HLA－DR均呈阴性表达，通过对ASCs细胞表面标志物的测定，证实ASCs细胞具有间充质干细胞的生物学特性。

3．CsA－NP对ASCs增殖的影响:关于CsA－NP对ASCs增殖的影响(图3)，与不同浓度的CsA－NP对ASCs作用时间相关。总之，与对照组比较，CsANP浓度在(0．01～1．00μmol/L)之间，时间多数在3天以内对细胞增殖有明显促进作用(P＜0．01);其中又以0．5μmol/L的CsA－NP剂量组为最佳，甚至在第5天都对细胞增殖有促进作用。而5μmol/L的CsA－NP剂量组对细胞增殖分化甚至有抑制作用。

讨 论

图2 流式细胞仪检测ASCs分子表型

图3 不同浓度CsA－NP、不同时间对ASCs增殖的影响A．0μmol/L;B．0．01μmol/L;C．0．1μmol/L;D．0．05μmol/L;E．1μmol/L;F．5μmol/L

本项研究表明，CsA－NP在低剂量(0．01～1.00μmol/L)、短时间(1～3天)促进 ASCs细胞增殖，呈现明显剂量－效应和时间－效应。CsA是临床上广泛应用的高效免疫抑制剂，近年来，研究表明CsA能促进细胞增殖。Yan等［1］给大鼠的胚胎干细胞添加CsA(1～3μg/ml)获得了10～20倍心脏祖细胞的倍增效果，1个胚胎干细胞最后可诱导分化为200个心肌细胞，分化的心肌细胞成功移植到大鼠心肌梗死模型中，修复了心肌梗死瘢痕，恢复了左室功能。随后，该研究团队又用人类多潜能干细胞心脏祖细胞诱导、扩增为心肌细胞，添加CSA(1～3μg/ml)组比对照组细胞数量增加了4．3倍，且这种心肌细胞几乎完全具备人类心肌细胞特征［2］。还有研究表明，CSA促进人类牙龈细胞、成纤维细胞增生同样呈现剂量 － 效应和时间 － 效应［3，4］。由此推论，CSA 能极大增强心肌细胞产量，无论在动物心肌细胞还是人类心肌细胞均获得了成功。此技术无疑为获得大量人类心肌细胞提供了可能的捷径。虽然目前对CSA的诱导分化潜能、促进细胞增殖机制仍不清楚，但有研究表明，CSA的这种促进细胞增殖作用机制完全不同于免疫抑制作用。同样是该研究小组又尝试了另外的钙调磷酸酶免疫抑制剂FK506和NF－AT nuclear factor of activated T cells(NFAT)制剂 11RVIVIT，却并未达与CSA同样促增殖效果，提示CSA的诱导分化细胞潜能并不是通过免疫抑制途径实现的［1］。有趣的是，最近的临床研究证实CSA能阻止心脏的缺血－再灌注损伤，比较一致的观点认为是CSA通过与线粒体基质的环孢菌素受体(cyclophilin D，CyP－D)特异性结合，而阻止线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放，从而抑制心肌细胞的凋亡［5，6］。虽然不清楚CSA促增殖和抗凋亡作用是否有内在联系，但基础研究为临床心脏再生提供了可能使用的一种药物，添加CSA可能提高心肌细胞的产量和效能。而CsA－NP作为纳米制剂，具有靶向、低毒、高效等优势，有理由相信对ASCs细胞增殖的影响将优于CsA。

本项研究检测结果提示ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105 均呈阳性表达，而 CD31、CD34、CD45、HLA－DR均呈阴性表达，证实本项研究培养的ASCs细胞具有间充质干细胞的生物学特性，与公认的ASCs细胞表面标志物相一致。总之，ASCs由于脂肪组织来源广泛，取材方便，可获得的基质细胞数量大，易于培养扩增，又具有细胞产量高、衰减速度慢、无免疫原性，无伦理学困扰等优势，成为最具吸引力的干细胞来源之一［7，8］。

1 Yan P，Nagasawa A，UosakiH，etal．Cyclosporin－A potently induces highly cardiogenic progenitors from embryonic stem cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，379(1):115 －120

2 Masataka F，Peishi Y，Tomomi O，et al．Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with cyclosporin － A［J］．PLoSONE，2011，2(22):1 －10

3 Andrukhov O，Matejka M，Rausch FX．Effectof cyclosporin A on proliferation and differentiation of human periodontal ligament cells［J］．Acta Odontologica Scandinavica，2010，68(6):329 －334

4 Cotrim P，Martelli－ Junior H，Graner E，et al．Cyclosporin A induces proliferation in human gingival fibroblasts via induction of transforming growth factor－ beta1［J］．JPeriodontol，2003，74(11):1625 － 1633

5 Gomez L，Thibault H，Gharib A，etal．Inhibition ofmitochondrial permeability transitionimproves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice［J］．Heart Circ Physiol，2007，293(3):H1654 －H1661

6 Piot C，Croisille P，Staat P，et al．Effect of cyclosporine on reperfusion injury in acutemyocardial infarction［J］．N Engl JMed，2008，359(5):473－481

7 Poglio S，De Toni－ Costes F，Arnaud E，et al．Adipose tissue as adedicated reservoir of functionalmast cell progenitors［J］．Stem Cells，2010，28(11):2065 －2072

8 Shi CZ，Zhang XP，Lv ZW，et al．Adipose tissue－derived stem cells embedded with eNOS restore cardiac function in acute myocardial infarction model［J］．Int JCardiol，2012，154(1):2 － 8