高速逆流色谱法分离纯化丁公藤中东莨菪内酯

高赛男 李森 张林娜 孙跃 张福琴

1.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆163319；2.北京四环科宝制药有限公司，北京100071

高速逆流色谱法分离纯化丁公藤中东莨菪内酯

高赛男1李森1张林娜1孙跃2张福琴2

1.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆163319；2.北京四环科宝制药有限公司，北京100071

目的探讨高速逆流色谱法（HSCCC）分离丁公藤中东莨菪内酯的可行性及工艺。方法用纯甲醇超声萃取三次，得到丁公藤粗提物，再用HSCCC技术分离得到高纯度的东莨菪内酯。结果正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统（体积比为3.0∶5.0∶3.5∶5.0）具有较好的分离效果；较佳工艺条件为：转速850 r/min、流动相流速2 mL/min和水浴温度25℃。结论采用HSCCC技术分离得到的东莨菪内酯样品经高效液相色谱法检测，纯度可达98.04%。

高速逆流色谱法；丁公藤；东莨菪内酯；高效液相色谱法

丁公藤，是旋花科植物丁公藤（Erycibe obtusifolia Benth.）或光叶丁公藤（Erycibe schmidtii Craib）的干燥藤茎，全年均可采收，切段或片，晒干[1]，制成中药饮片，具有解表发汗、抗炎、疏风祛湿、舒筋活络、消肿止痛等功效。丁公藤的化学成分主要有东莨菪内酯、东莨菪苷、咖啡酸和氯原酸等[2-3]，其中东茛菪内酯具有祛风、抗炎、止痛、抗真菌和抗肿瘤作用[4]，因此建立东莨菪内酯的分离提纯方法具有重要意义。

高速逆流色谱（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是近年来发展起来的新型、不使用固态支撑体或载体的连续液-液分配色谱技术，具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点[5-6]，已被广泛应用于天然药物成分的分析鉴定及分离制备。东莨菪内酯为香豆素类化合物，目前香豆素的传统分离多采用柱色谱和薄层色谱法，操作繁琐，本实验采用半制备型高速逆流色谱仪从丁公藤粗提物中成功分离纯化出东莨菪内酯，经高效液相色谱峰面积归一化法分析，纯度达到98.04%，为香豆素类化合物的高效、方便和快速分离提供了有效借鉴。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

TBE 300B高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司），AKTA prime泵及检测系统（美国通用电器医疗集团），LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），HH-1型数显恒温水浴锅（江苏省荣华仪器制造有限公司），9312A型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），DFT-100J型手提式高速中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），C3860型超声波清洗器（河南省巩义市英峪予华公司），Milli-Q Academic超纯水器（法国密理博有限公司）。

1.2 试剂

东莨菪内酯标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110768-200504），粗提物的制备及高速逆流所用的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯和甲醇均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），HPLC分析用甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），实验室用水是自制的超纯水。

丁公藤购自安徽省亳州市药材总公司，经哈尔滨医科大学大庆校区药学院申志英副教授鉴定确认为光叶丁公藤的干燥藤茎。

2 方法与结果

2.1 样品制备

称取丁公藤粉末（过40目筛）300 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇500 mL，放置过夜。超声30 min，过滤，滤渣再分别用500 mL的甲醇超声过滤两次，合并滤液，滤液经减压浓缩后转移到真空干燥器中干燥，最后得到丁公藤干浸膏5.40 g，称取适量的干浸膏用甲醇溶解并定容，备用。

2.2 标准品溶液制备

准确称取一定量的东莨菪内酯标准品，置5 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声10 min，冷却后补足体积，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 高速逆流溶剂系统的选择

对样品进行分离的必要条件是在互不相溶的两相中具有合适的分配系数，分配系数值过小，待分离物来不及分离，就随着流动相流了出来；但是分配系数值太大的话，分离时间过长，浪费试剂，理想的分配系数值应在0.5～1.5之间。按照所需比例，配制20 mL的溶剂，置于分液漏斗中静置过夜。称取待测样品适量放入5 mL的试管中，吸取上、下相溶剂各2 mL，充分振摇，静置分层，分别取上、下相液体用HPLC检测东莨菪内酯的峰面积，设上、下相峰面积分别为A1和A2，根据公式K=A1/A2，求出分配系数值。根据丁莨菪内酯的极性，重点考察了HSCCC中常用于中等极性物质分离的溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，研究了不同溶剂配比对目标组分东莨菪内酯分配系数K值的影响。

结果发现，随着体系中甲醇/水比例的增加，分配系数K值出现下降的趋势。当正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积配比调为3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0时，K值分别为0.60和1.28，满足理想的K值范围，可以进行下一步的试验。

2.4 高速逆流色谱分离效果考察

用分液漏斗分别配制2 000 mL体积比为3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的两种溶剂系统，密封振荡混合后静置分层过夜，分出上相（固定相）和下相（流动相），超声脱气30 min。打开循环水浴，预热高速逆流色谱系统，待水浴温度达到设置温度25℃后，打开泵，将固定相以30 mL/min的流速泵入分离柱，等有液体流出后按泵暂停键；开启主机转速控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按顺时针方向旋转，当转速达到850 r/min后，再以2 mL/min的流速泵入流动相。用量筒收集柱后流出物，首先从溢出口流出的是固定相，待有流动相流出时，按泵暂停键，读出流出的固定相体积Vs。根据保留在分离柱内的固定相体积占分离柱总容积Vt的比例就可求出固定相的保留率R，即：R=

实验结果表明，体积比为3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的两种溶剂系统，对应的固定相保留率均在0.7左右，两种溶剂系统似乎不存在什么差别。但是把供试液注入进样环后，以2 mL/min的流速对丁公藤粗提液进行分离，却可从两者的分离效果图中看出它们的差别。

从图1可以看出，当正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积配比3.0∶5.0∶3.5∶5.0时，180 min内，主要有两个峰出现，峰形尖锐，分离效果良好；但是当体积配比为3.0∶5.0∶3.0∶5.0时，对应两个组分的峰形很钝，分离效果不好，因此采用体积配比为3.0∶5.0∶3.5∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系，并用试管分别收集在123～140 min和142～163 min两个时间段所对应峰的流出物，记为收集液a和收集液b，备用。

2.5 高效液相色谱分析

2.5.1 高效液相色谱条件色谱柱是日本岛津公司的Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm），检测波长是347 nm，流动相由甲醇和水（30∶70，V/V）构成，总流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

2.5.2 高效液相色谱用供试液的制备将收集得到的a、b两个流分分别蒸干，用甲醇溶解，0.45 μm的微孔滤膜过滤后定容，得到纯化后的供试品溶液，备用。

2.5.3 分离样品的测定参照“2.5.1”项下色谱条件，分别对东莨菪内酯标准品、a和b三种溶液进行图谱分析，发现丁公藤粗提液在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3.0∶5.0∶3.5∶5.0）溶剂体系下，溶液b的保留时间与东莨菪内酯标准品的一致，因此判断收集液b为东莨菪内酯，纯度高达98.04%。

3 讨论

考察了不同溶剂（甲醇、乙醇和70%乙醇）和不同提取方法（超声和加热回流）对东莨菪内酯含量的影响，结果发现，采用甲醇超声提取时，操作简单，得到的东莨菪内酯含量最高。而在选择高速逆流色谱溶剂系统时，考查了不同体积配比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系，经比较发现，当四种溶剂的体积比为3.0∶5.0∶3.5∶5.0时，丁公藤粗提液的分离效果最好，分离出来的东莨菪内酯纯度达到98.04%，此方法可为以后分离各类酯类化合物提供有益借鉴。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：1.

[2]谭建宁，张赞赘.不同来源丁公藤药材中东莨菪内酯含量的研究[J].中成药，2008，30（11）：1651-1653.

[3]陈玉敏，曹红，周苏萍，等.高效液相色谱法测定丁公藤中东莨菪内酯的含量[J].中成药，2005，27（12）：1461-1462.

[4]孙文基.天然活性成分简明手册[M].北京：中国医药科技出版社，1998：507.

[5]韩忠明，王云贺，韩梅，等.高速逆流色谱分离纯化防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷[J].分析化学，2009，37（11）：1679-1682.

[6]张天佑.逆流色谱技术[M].北京：北京科学技术出版社，2001：171.

Isolation and purification of scopoletin from Erycibe obtusifolia by highspeed counter-current chromatography

GAO Sainan1LI Sen1ZHANG Linna1SUN Yue2ZHANG Fuqin2
1.College of Pharmacy,Daqing Campus of Harbin Medical University,Heilongjiang Province,Daqing163319,China; 2.Sihuankebao Pharmaceuticals Co.Ltd.,Beijing100070,China

Objective To study the feasibility and techniques for isolating scopoletin from Erycibe obtusifolia by highspeed counter-current chromatography(HSCCC).Methods Erycibe obtusifolia was ultrasonically extracted in 100% methanol three times,and then a HSCCC unit was used to get high purity of scopoletin.Results The preferable solvent system was composed of hexane-ethyl acetate-methanol-water(3.0∶50∶3.5∶5.0,V/V),and the preferable technical conditions were as followed:the rotate speed was 850 r/min,the mobile phase flow rate was 2 mL/min,and the bath temperature was 25℃.Conclusion The purity of scopoletin sample isolated by HSCCC is 98.04%through the technique of high performance liquid chromatography(HPLC).

HSCCC;Erycibe obtusifolia;Scopoletin;HPLC

R284.2

A

1673-7210（2012）09（b）-0122-03

2012-05-03本文编辑：卫轲）

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目编号：11551178）。[作者简介]高赛男（1975-），女，湖南永顺人，土家族，硕士研究生，讲师，主要从事天然药物活性成分高效分离。