长双歧杆菌液态发酵条件的优化及生长曲线的测定

冯伟华 常艳璐▲

1.内蒙古医科大学附属医院药剂科，内蒙古呼和浩特010059；2.北京天坛医院药剂科，北京100050

长双歧杆菌液态发酵条件的优化及生长曲线的测定

冯伟华1常艳璐2▲

1.内蒙古医科大学附属医院药剂科，内蒙古呼和浩特010059；2.北京天坛医院药剂科，北京100050

目的优化长双歧杆菌的液态发酵条件。方法通过单因素试验方法，考察长双歧杆菌液态培养基的最佳初始pH、培养温度、接种量和培养时间。结果长双歧杆菌的最佳发酵条件为：发酵液初始pH 7.0、发酵培养温度39℃、发酵接种量6%、最佳培养时间8～10 h。结论本课题研究确定的发酵工艺有效地提高了长双歧杆菌的培养效率。

长双歧杆菌；发酵条件的优化；生长曲线

双歧杆菌（bifidobacterium longum）是人体消化道内具有益生作用的优势菌群，其具有的生理功能包括：调整肠道菌群[1-2]，增强免疫系统[3]，防止便秘，治疗溃疡性结肠炎[4-5]，产生抗生素，提高蛋白质和维生素的代谢，抗衰老，治疗肝损伤，抗肿瘤，降低胆固醇等[6]。双歧杆菌对机体生理功能的重要作用，促使了含双歧杆菌的食品工业和医药工业的发展。

本实验以长双歧杆菌为发酵菌株，以TPY改良培养基[7]为基础培养基，通过对发酵条件（培养基初始pH、培养温度、接种量）的考察，确定了长双歧杆菌的最佳培养条件；通过对长双歧杆菌生长曲线的测定，确定了长双歧杆菌的最佳发酵培养时间，同时也验证了该菌的发酵工艺。

1 仪器与试药

1.1 试剂与菌种

长双歧杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心。氮源：北京双旋微生物培养基制品厂。

1.2 实验设备

Primo Star显微镜：德国卡尔蔡司公司（Zeiss）；Moticam 2306显微摄影仪：Moticam公司；垂直层流洁净工作台CA-1390-1：上海上净净化设备有限公司；LDZX-40SBI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。

1.3 液态发酵培养基

TPY液体培养基：葡萄糖2%、酪蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉蛋白胨1%、水解乳蛋白2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、吐温-80 0.1%、MgSO40.05%、MnSO40.02%、K2HPO40.05%。用5%的NaOH调节pH为6.8。培养基121℃灭菌30min，至4℃冰箱保存。

2 方法与结果

2.1 发酵液活菌数的检测

采用平板混菌计数法，即将发酵液菌浓度逐级稀释至10-6倍、10-7倍、10-8倍，然后吸取1 mL稀释液加入到灭菌的空白平皿中，每个样平行做3块平皿，再倒入50～55℃的TPY培养基15～20 mL，摇匀，待培养基凝固后，将平皿倒置放于38℃恒温厌氧培养箱中，培养48 h后计数。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 发酵培养基的培养方法

液体发酵培养采取三级培养的方法，一级、二级培养基为种子培养基，其作用是活化菌种，并起到扩大培养的作用，三级为发酵培养，本实验每级分装50 mL培养液到100 mL三角瓶中，放置厌氧培养箱中，37℃培养12 h。接种过程为：由冻干菌种接入一级种子培养基，培养12 h后按5%的接种量接入二级种子培养基，二级培养12 h后，按5%的接种量接入三级发酵培养基，培养12 h后为发酵终点。

2.2.2 发酵液初始pH的优化

按配方配制好培养基后，用5%的NaOH或5%乙酸调节pH，按表1调节不同的pH，其中5号为原对照。

表1 发酵液初始pH

2.2.3 发酵培养温度的优化

按配方配制好培养基后，调节厌氧培养箱的温度，按表2考查不同的培养温度，其中3号为原对照。

表2 发酵培养温度表

2.2.4 发酵接种量优化

按配方配制好培养基后，考查一级到二级，二级到三级的接种量，按表3选取考查不同的接种量，其中3号为原对照。

表3 发酵接种量表

2.3 发酵生长曲线的测定

按配方配制好培养基后，连续接入13瓶相同的三级培养基，放入厌氧箱培养，按表4所示的不同时间点取出后检测活菌数。

2.4 实验结果

2.4.1 发酵条件的优化结果

2.4.1.1 发酵液初始pH的优化调节不同的pH后，发酵液活菌数有较大的变化，见表5。

由表5可知，6号发酵液活菌数均值最高，因此确定培养基最佳初始pH值为7.0。

2.4.1.2 发酵培养温度的优化依据上步实验结果，将培养基初始pH调节为7.0，设定不同的培养温度后，发酵液活菌数有较大的变化，见表6。

由表6可知，5号发酵液活菌数均值最高，因此确定最佳培养温度为39℃。

2.4.1.3 发酵接种量优化结果依据上步实验结果，将培养基初始pH调节为7.0，将培养温度设定为39℃，接入不同量的种子培养基后，发酵液活菌数有较大的变化，见表7。

由表7可知，4号发酵液活菌数均值最高，因此确定培养基最佳接种量为6%。

2.5 发酵生长曲线测定结果

依据上步实验结果，将培养基初始pH值调节为7.0，将培养温度设定为39℃，培养基接种量为6%，放入厌氧箱培养，间隔1 h取样测定发酵液活菌数，见表8。

由图1可以看出，0～1 h是菌体的适应期，2～7 h是菌体的对数生长期，8～10 h是菌体的稳定生长期，10 h以后菌体进入衰亡期，且8～10 h菌体活菌数相对其他时间段最高，因此确定8～10 h为发酵培养的最佳时间。

综上，通过对发酵液不同初始pH（6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0）的考察，最终确定发酵液最佳初始pH为7.0。通过对不同发酵培养温度（35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃）的考察，最终确定发酵最佳培养温度为39℃。通过对不同发酵接种量（3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）的考察，最终确定发酵最佳接种量为6%。通过对发酵生长曲线的测定，最终确定最佳培养时间为8～10 h。通过对发酵液初始pH、发酵培养温度、发酵接种量的考察，以及对发酵生长曲线的测定，最终确定长双歧杆菌的最佳发酵条件为：发酵液初始pH 7.0、发酵培养温度39℃、发酵接种量6%、最佳培养时间8～10 h。发酵液活菌数最高可达到2.663×109cfu/mL，大大地提高了长双歧杆菌的培养效率。

表4 发酵生长曲线测定时间

表5 发酵液初始pH优化结果

表6 发酵培养温度优化结果

表7 发酵接种量优化结果

表8 发酵生长曲线测定结果

3 讨论

在发酵条件优化过程中，笔者发现调节较低的初始pH会造成菌体初期生长过快，而缩短了对数生长期的生长，pH太高会造成菌体生长太慢，发酵液活菌数不高。在考察不同的培养温度时，温度太低或太高都不利于菌体的生长，温度调节为39℃菌体生长较快，且发酵液活菌数较高，可能由于此温度是菌体内大多数酶的最佳作用温度。在考察不同的接种量时，笔者发现接种量太低菌体生长过慢，菌体的适应期延长，造成菌体生长状况不好；而接种量太高时菌体生长过快，以至于菌体较早进入对数生长期，培养基中营养物质利用太快，从而限制了菌体的进一步生长。

[1]李俊洁，陈庆森.双歧杆菌调理和改善肠道相关疾病作用的研究进展[J].食品科学，2011，32（23）：326-331.

[2]Marteau P，Rdevrese M，Cellier CJ，et al.Protection from gastrointestinal disease with the use of probiotics[J].Am J Clin Nutr，2001，73（2）：430-436.

[3]王长文，张岚，马洪波.双歧杆菌对肠黏膜粘附及免疫调节功能的研究进展[J].吉林医药学院学报，2010，31（1）：42-45.

[4]丁圣，蒋菁莉，刘松玲，等.长双歧杆菌BBMN68对便秘模型小鼠的通便作用[J].食品科学，2011，32，（3）：195-198.

[5]王志强，于振海，袁方曙.双歧杆菌对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜上皮细胞Toll样受体2、4及NF-κB基因表达的影响[J].山东大学学报：医学版，2011，49（5）：10-14.

[6]陈葙南.双歧杆菌的生理功效及应用研究进展[J].科技创新导报，2010，（11）：1-3.

[7]杨洁彬，彭倍勤.乳酸菌生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版社，1996：182.

The optimization of lipuid fermentation conditions and the determination of growth curve for bifidobacterium longum

FENG Weihua1CHANG Yanlu2▲
1.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot010059,China;2.Department of Pharmacy,Beijing Tiantan Hospital,Beijing100050,China

Objective To optimize the fermentation conditions for bifidobacterium longum.Methods By the single-factor test,the best initial pH,incubation temperature,inoculum size and incubation time of the culture medium for bifidobacterium longum were investigated.Results The optimal fermentation conditions of bifidobacterium longum were as follow:the initial pH of fermentation broth was 7.0,the fermentation temperature was 39℃,the fermentation inoculation size was 6%, the best incubation time was 8-10 h.Conclusion This fermentation technology effectively improves the efficiency of the cultivation of bifidobacterium longum.

Bifidobacterium longum;Optimization of fermentation conditions;Growth curve

TQ925

A

1673-7210（2012）11（a）-0115-03

2012-06-15本文编辑：卫轲）

▲通讯作者