不同生长年限对丹参活性成分含量的影响△

刘伟，刘建华，周洁，王晓*，耿岩玲，李奉胜

(1.山东省科学院中药过程控制研究中心/山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.莱芜紫光生态园有限公司，山东 莱芜 271100)

国家自然科学基金(81102749)；山东省科技发展计划(2011GSF11908，2012GGA12024)；山东省科学院科技发展计划(科基合字(2011)第3号)

*

王晓，Tel：(0531)82605304，E-mail：wangxiao2008@yahoo.cn

不同生长年限对丹参活性成分含量的影响△

刘伟1，刘建华1，周洁1，王晓1*，耿岩玲1，李奉胜2

(1.山东省科学院中药过程控制研究中心/山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.莱芜紫光生态园有限公司，山东 莱芜 271100)

目的研究不同生长年限对山东白花丹参及紫花丹参活性成分含量的影响。方法采用HPLC法测定不同生长年限白花及紫花丹参中脂溶性成分(二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮)和水溶性成分(丹酚酸B、迷迭香酸)含量。结果1年生白花丹参5种脂溶性成分总含量为6.18 mg·g-1，2年生总含量为 3.63 mg·g-1，而1年生紫花丹参5种脂溶性成分总含量为7.08 mg·g-1，2年生总含量为7.06 mg·g-1；1～2年生白花丹参中水溶性成分总量分别为44.44 mg·g-1和43.19 mg·g-1，紫花丹参分别为38.89 mg·g-1和49.12 mg·g-1。结论比较丹参活性成分总含量，白花丹参以1年生质量为佳，紫花以2年生综合品质为佳；相同砂质土壤栽培条件下的紫花丹参质量高于相同年限的白花丹参。

丹参；生长年限；脂溶性成分；水溶性成分

中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，其有效成分为脂溶性的菲醌类衍生物和水溶性的酚酸类成分。前者具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等作用，而后者主要作用为抗氧化、抗肝损伤、保护心肌等[1]。根据开花颜色丹参分为紫花和白花两类，一般常用中药丹参为紫花丹参，而白花丹参SalviamiltiorrhizaBge. F. alba.为其变型，其花颜色为白色，区别于普通丹参的紫红色，野生白花丹参主要分布在山东泰沂山脉，为山东道地药材[2]。研究表明，白花丹参丹参酮ⅡA、丹酚素含量较高[3]，其药理作用对血栓闭塞性脉管炎有独特疗效[4]。丹参中成分除丹参酮和丹酚酸B外，还含有像隐丹参酮、丹参新酮、二氢丹参酮、迷迭香酸等物质[5]，且其含量均较高。

本研究以1年生及2年生白花丹参、紫花丹参为研究对象，对丹参中脂溶性、水溶性多个成分进行同时测定，研究不同生长年限对白花丹参及紫花丹参活性成分的影响，明确不同丹参及生长年限对其质量的影响，对丹参质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪；Agilent DAD检测器；Agilent Chemstation工作站。

1.2 材料

1.2.1 药材 丹参样品，白花丹参及紫花丹参采集于山东莱芜苗山镇莱芜紫光生态园丹参种植基地，基地土壤背景一致，样品采集时间为2011年11月2日，分别选择长势一致的丹参样品4株作为每个处理的重复样品。采集的样品在同一条件下阴干，磨碎，装入封口袋中密封冷藏。原植物经山东中医药大学李佳副教授鉴定为白花丹参及紫花丹参。

1.2.2 对照品 二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B(天然产物国家标准样品参比实验室制备，纯度≥98%)、迷迭香酸(批号：MUST-12020702，纯度≥98%，购自成都曼思特生物科技有限公司)。

1.2.3 试剂 甲醇(色谱纯)，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 脂溶性成分测定方法 提取方法：按照田宇红的方法[6]，取丹参粉末1.000 g，置磨口锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密称定重量，加热回流1 h，放冷后称重，用甲醇补足减损的重量，摇匀后过滤，过0.45 μm滤膜，HPLC测定。见图1。

色谱条件：Inertsil-1色谱柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，脂溶性成分测定条件：流动相为乙腈-0.2%醋酸(55∶45)，检测波长为270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温20 ℃，进样体积20 μL。

1.3.2 水溶性成分测定方法 提取方法：按照文献方法[7]，取丹参粉末1.000 g，置磨口锥形瓶中，加入60%甲醇50 mL，超声30 min，过0.45 μm滤膜，HPLC测定。见图2。

色谱条件：梯度洗脱，流动相初始比例为0.2%醋酸-乙腈(95∶5)，测定时间为40 min，30 min时流动相变为0.2%醋酸-乙腈(65∶35)，30～36 min流动相为100%乙腈，37～43 min变为初始流动相；检测波长为280 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温20 ℃，进样体积20 μL。

1.4 标准曲线的制备

分别精密称取经减压干燥24 h后的二氢丹参酮0.5 mg，隐丹参酮3.0 mg，丹参酮Ⅰ3.9 mg，丹参酮ⅡA3.3 mg，溶于甲醇后定容至10 mL，稀释5倍作为混合对照品溶液。称取丹参新酮5.2 mg溶于甲醇定容至10 mL，稀释10倍作为对照品溶液；称取丹酚酸B 3.2 mg，迷迭香酸3.7 mg分别溶于甲醇后定容至10 mL，作为水溶性成分测定对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

取上述混合对照品溶液及丹参新酮对照品溶液，分别进样0、5、10、15、20 μL(丹参新酮进样0、1、2、3、4 μL)，按方法中条件测定峰面积。以进样标准样品量为横坐标(X)，千分之一峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

表1 丹参活性成分标准曲线

A.脂溶性成分对照品 B.丹参新酮对照品 C.丹参样品1.二氢丹参酮 2.隐丹参酮 3.丹参酮Ⅰ 4.丹参酮ⅡA 5.丹参新酮图1 丹参脂溶性成分HPLC图谱

A.迷迭香酸对照品 B.丹酚酸B对照品 C.丹参样品1.迷迭香酸 2.丹酚酸B图2 丹参水溶性成分HPLC图谱

2.2 精密度试验

精密吸取标准溶液20 μL，连续进样5次，测定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B、迷迭香酸7种成分的峰面积，平均峰面积分别为11 185×103、62 409×103、13 247×103、98 356×103、4 467×103、19 4127×103、15 535×103。RSD分别为0.5%、0.8%、6.3%、0.7%、1.7%、0.3%、0.8%。

2.3 稳定性考察

取同一批丹参样品5份，按方法中色谱条件进行测定，测定时间分别为0，2，4，6，8 h，结果二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B、迷迭香酸峰面积平均值分别为10 590×103、61 450×103、12 602×103、95 653×103、4 328×103、203 861×103、15 728×103。RSD分别为3.3%、5.2%、3.9%、3.1%、3.3%、3.7%、1.0%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.4 重复性试验

取同一批丹参样品5份，按方法中色谱条件进行测定，结果二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B、迷迭香酸峰面积平均值分别为10 379×103、61 146×103、13 677×103、96 462×103、4 398×103、189 961×103、15 222×103。RSD分别为3.9%、3.0%、2.8%、2.5%、2.5%、2.2%、1.8%。

2.5 回收率测定

取已知含量丹参样品，二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B、迷迭香酸含量分别为0.30、1.16、1.37、5.13、0.29、35.26、1.12 mg·g-1，根据测定方法称取1 g已知含量丹参样品(水溶性物质测定称取0.1 g)，分别加入0.3、1.2、1.4、5.0、0.3、3.5、0.1 mg对照样品，后按照方法进行提取测定，测得峰面积平均值分别为19 661×103、12 3624×103、29 364×103、201 633×103、9 132×103，样品回收率分别为108%、97.7%、113%、108%、99.8%、90.9%、91%。

2.6 样品测定

分别取不同生长年限的样品，按上述方法测定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮、丹酚酸B、迷迭香酸的峰面积，分别按干燥品计算含量。

采用最小差异显著法进行多重比较分析，其中A, B, C表示差异具有统计学意义(P<0.01)；a, b, c表示差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2为不同生长年限丹参中脂溶性成分的含量。结果表明，1年生白花丹参中脂溶性成分均比2年生含量高，其中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参新酮含量分别比2年生丹参高110.0%、33.3%、78.4%、100%。生长年限对白花丹参中5种脂溶性成分的影响率为隐丹参酮>丹参新酮>丹参酮ⅡA>丹参酮Ⅰ>二氢丹参酮。

生长年限对紫花丹参中各脂溶性成分的影响不一致，其中2年生丹参中丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量高于1年生，二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参新酮的含量则以1年生为高。

相同生长年限的不同丹参比较结果表明，紫花丹参脂溶性成分含量均比相同生长年限的白花丹参含量高。1年生白花丹参5种脂溶性成分总含量为6.18 mg·g-1，2年生总含量为3.63 mg·g-1，而1年生紫花丹参5种脂溶性成分总含量为7.08 mg·g-1，2年生总含量为7.06 mg·g-1。

表3为不同生长年限丹参中水溶性成分的含量比较。结果表明，生长1～2年对白花丹参中2种水溶性成分影响不一致。2年生白花丹参中迷迭香酸的含量明显高于1年生，而丹酚酸B的含量差异不明显。

表2 不同生长年限丹参脂溶性成分含量测定 /mg·g-1

注：大写字母表示P<0.01，小写字母表示P<0.05，下同。

紫花丹参中两种水溶性成分均以2年生含量较高，丹酚酸B和迷迭香酸的含量分别比1年生高25.1%和58.7%，差异水平均达到极显著。

1年生白花中丹酚酸B的含量明显高于紫花丹参，但迷迭香酸含量低于紫花丹参；2年生紫花丹参中的丹酚酸B和迷迭香酸含量均显著高于白花丹参。

表3 不同生长年限丹参水溶性成分含量测定 /mg·g-1

不同丹参其活性成分含量存在差异，李正国[8]研究结果表明，紫花丹参和白花丹参脂溶性成分总含量8月份最高，分别为1.02%和1.21%；徐翠红[9]研究结果表明，各有效成分在紫花丹参和白花丹参中的变化规律基本一致，但总体上白花丹参各药用成分含量大于紫花丹参。本研究表明，1年生白花丹参的二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量明显低于1年生的紫花丹参，而丹酚酸B的含量明显高于紫花丹参；对2年生白花丹参而言，其5种脂溶性成分以及2种水溶性成分含量均低于相同年限的紫花丹参；除迷迭香酸含量外，1年生白花丹参脂溶性成分均高于2年生，所以白花丹参以1年生质量为佳；而2年生紫花丹参水溶性成分的含量明显高于1年生。

药用植物有效成分的合成积累与环境因子密切相关，土壤、温度、光照、水分等环境条件通过单一或相互作用影响着药用植物的品质[10]，在种源明确的条件下，环境因子是控制人工栽培药材成功与否的关键。1～2年生白花丹参除丹酚酸B外其他活性成分均低于紫花丹参，说明白花丹参更适合于取样地点的砂质土壤，而紫花丹参在此条件下处于逆境状态，更有利于合成次生代谢物质。

3 结论

3.1 生长年限对白花丹参的影响

生长年限对白花丹参的影响主要表现在脂溶性物质上，1年生白花丹参中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和丹参新酮4种成分的含量均高于2年生丹参，且差异具有统计学意义(P<0.05)；生长年限对白花丹参中水溶性成分的影响主要表现在迷迭香酸上，2年生白花丹参的迷迭香酸含量明显高于1年生。

3.2 生长年限对紫花丹参的影响

生长年限对紫花丹参中各脂溶性成分的影响不一致，水溶性成分以2年生为高。

3.3 相同年限不同丹参活性成分比较

1～2年生紫花丹参中脂溶性成分和迷迭香酸含量高于相同年限的白花丹参，1年生丹参丹酚酸B的含量以白花丹参为高，而2年生则以紫花丹参为高。

[1] 李文喆，王勇.丹参药用成分研究进展[J].人民军报，2008，51(3)：180.

[2] 王峰祥，闫永亮，毛淑敏，等.白花丹参野生资源濒危保护和开发利用研究[J].中国现代中药，2009，11(8)：17-18.

[3] 李志田，杨保津，马广恩.白花丹参化学成分的研究[J].药学学报，1991，2(3)：209-213.

[4] 闫永亮，毛淑敏，王峰祥，等.人工种植白花丹参最佳采收期的初步研究[J].中国现代中药，2009，11(7)：12-14.

[5] 王维婷，单成钢，倪大鹏，等.丹参有效成分代谢生理生化及分子生物学研究进展[J].中药材，2009，32(9)：1472-1476.

[6] 田宇红，王喆之，强小利.HPLC法测定12种不同形态丹参脂溶性成分[J].光谱实验室，2010，27(1)：87-89

[7] 陈兆伟，张金家，赵淑娟，等.茉莉酸甲酯对丹参毛状根中水溶性酚酸类化合物积累的影响[J].中国药学杂志，2010，45(13)：970-974

[8] 李正国，于立佐.不同采收期山东产丹参脂溶性成分含量变化的研究[J].齐鲁药事，2007，26(7)：401-402.

[9] 徐翠红，舒志明，王研，等.紫花丹参和白花丹参不同器官主要药用成分积累规律研究[J].时珍国医国药，2010，21(9)：2129-2132.

[10] 黄璐琦，郭兰萍.环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J].中国中药杂志，2007，32(4)：277-280.

InfluenceofDifferentGrowthYearonActiveConstituentsinSalviamiltiorrhizaBge.andSalviamiltiorrhizaBge.F.alba.

LIU Wei1, LIU Jian-hua1, ZHOU Jie1, WANG Xiao1, GENG Yan-ling1，LI Feng-sheng2

(1.ProcessControlResearchCenterofTCM,SDAS/ShandongAnalysisandTestCenter,Jinan, 250014,China;2.LaiwuZiGuangecologicalcompany,Laiwu271100,China)

Objective:To study the influence of different growth year on the content of active constituents inSalviamiltiorrhizaBge. andSalviamiltiorrhizaBge. F. alba..MethodsHPLC method was used to determine the contents of the liposoluble constituents(Dihydrotanshinone, Cryptotanshinone, Tanshinone, TanshinoneⅡA, Miltione) and water-soluble constituents(Salvianolic acid, Rosemarinic acid).ResultsContents of liposoluble constituents in both one- and two-year-oldSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. were 6.18 mg·g-1and 3.63 mg·g-1while 7.08 mg·g-1and 7.06 mg·g-1inSalviamiltiorrhizaBge., respectively. Contents of water-soluble constituents in both one-and two-year-oldSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. were 44.44 mg·g-1and 43.19 mg·g-1while 38.89 mg·g-1and 49.12 mg·g-1inSalviamiltiorrhizaBge., respectively.ConclusionThe quality of one year ofSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. was better than 2 years’，The quality ofSalviamiltiorrhizaBge. was better thanSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. when planted in sand soil.

SalviamiltiorrhizaBge.; Growth years; Content; Active constituents

2012-08-28)