响应面法分析优化米曲霉产β-葡萄糖苷酶液体发酵培养基

朱 婧，王青艳，，刘演景，申乃坤，陈桂光，梁智群，*

(1.广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西南宁530007; 2.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005)

响应面法分析优化米曲霉产β-葡萄糖苷酶液体发酵培养基

朱 婧1，王青艳1，2，刘演景2，申乃坤1，陈桂光2，梁智群2，*

(1.广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西南宁530007; 2.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005)

利用快速有效的响应面分析法对米曲霉ASPE0485产β－葡萄糖苷酶的发酵培养基进行优化，利用Plackett－Burman显著因子实验和Box－Behnken响应面分析优化了β－葡萄糖苷酶产生菌的发酵培养基，确定摇瓶发酵的最佳培养基组成为(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐温－80 0.27%和接种量5.3%;在此条件下发酵，得到酶活为21.1U/mL比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。

米曲霉，β－葡萄糖苷酶，响应面分析法

1 材料与方法

1.1 实验材料

米曲霉ASPE0485(Aspergillus oryzae ASPE0485)广西大学生命科学与技术学院食品与发酵工程研究所筛选并保藏;斜面培养基 10%(w/v)麸皮水煮30min，4层纱布过滤，滤液中添加2%葡萄糖，2%琼脂，pH自然;种子培养基 50mL Mandels［4］微量元素盐溶液中加入1%(W/V)植物蛋白胨，pH自然［5］;基础摇瓶培养基 3%(W/V)玉米芯，0.2%(W/V)植物蛋白胨，0.4%(W/V)KH2PO4，0.04%(W/V)CaCl2，0.04%(W/V)MgSO4，pH自然，定容至50mL［4］。

表2 PB设计及其实验结果Table 2 Experimental design and results of the PB

表3 PB设计的回归分析结果Table 3 Results of the PB regression analysis

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 种子液培养方法:250mL三角瓶装液量50mL，每瓶种子培养基的接种量为1×106个孢子，培养温度为28℃，摇床转速为160r/min，培养时间为12h。

发酵培养方法:250mL三角瓶装液量50mL，种子液以2%(V/V)的接种量接入发酵培养基，培养温度为28℃，摇床转速为160r/min，培养时间为4d。

1.2.2 酶活力的测定

1.2.2.1 酶活力测定 以0.5%水杨苷为底物，准备两管平行样及一个空白对照，各加入0.9mL底物(0.5%水杨苷)之后，各加入0.lmL酶液(以10s为间隔加样)，空白对照以灭活的酶样代替，50℃反应30min后，测定OD540。

1.2.2.2 酶活力定义 在此反应条件下(pH为4.8，温度为50℃)，每分钟每毫升酶液生成1μmol还原糖的酶量即一个酶活单位U，用U/mL表示［6］。

1.2.3 Plackett－Burman(PB)设计优化［7］选取7个因素，实际实验次数16次的Plackett－Burman(PB)设计，响应值为β－葡萄糖苷酶酶活，为估计误差增加4个中心点，实验重复三次，实验结果取3次的平均值。

1.2.4 最陡爬坡实验 以实验值变化的梯度方向为最陡爬坡法爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长逼近最佳值区域，初步估算响应面实验的中心点。

1.2.5 Box－Benhnken中心组合实验设计［8－9］根据Box－Benhnken中心组合实验设计原理，由Plackett－Burman实验筛选出的三个显著因子，并以最陡爬坡实验结果确定实验水平，设计了3因素3水平共15个实验点的响应面分析，如表1。

表1 Box－Behnken分析实验因素水平表Table 1 Levels of the variables in the Box－Behnken design

本实验用统计分析软件Minitab对实验结果进行分析。每次实验重复三次，每次三个平行。

2 结果与分析

2.1 Plackett－Burman(PB)设计实验结果

实验选用n=16的Plackett－Burman设计安排，各因素水平取值，实验设计及结果分别见表2。

利用Minitab软件分析各因素的主效应，结果见表3，7个因素中对响应值影响的显著性顺序为:玉米芯＞吐温－80＞接种量＞KH2PO4＞CaCl2＞大豆蛋白胨＞MgSO4·7H2O。实验中R2=0.9665。且根据表3中P值可知，玉米芯浓度、吐温－80浓度、接种量这3个因素的可信度都在90%以上，对β－葡萄糖苷酶产量影响显著，可考虑作为主要因素进一步响应面实验，在其后的实验中其他因素均为中心点水平。

2.2 最陡爬坡实验结果

响应面的拟合方程在考察的紧接邻域里才能充分近似真实的情形，因此要先逼近最佳值区域，才可以建立有效的响应面拟合方程。所以根据3个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验，设计及结果如表4所示。可见，最优发酵条件在实验2与实验3之间，有显著正效应，故以实验2的条件为响应面实验的中心点。

表4 最陡爬坡实验设计和结果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box－Behnken设计和响应面分析实验结果

依据Plackett－Burman实验和最陡爬坡实验确定的3因素，分别为X1、X2、X3，根据Box－Benhnken的中心组合实验设计原理，进行3因素3水平共15个实验点的实验设计，实验设计及结果见表5、表6。

表5 Box－Behnken实验设计与结果Table 5 Experimental design and response of the Box－Behnken

利用Minitab统计软件回归拟合实验数据(表6)可获得三元二次回归方程为:

回归方程方差分析显著性检验表明(表7)，该模型失拟不显著，回归显著。并且该模型决定系数R2=0.9772，离回归标准差S=0.67735，说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性可以应用于β－葡萄糖苷酶生产的理论预测。

表6 Box－Behnken实验的回归分析结果Table 6 Results of the Box－Behnken regression analysis

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance and regression for the selected quadratic model

2.4 培养基最适组合

根据回归方程可以利用Minitab绘出响应面分析图及其等高线，证实了拟合面有真实的极大值，见图1～图3。得出模型的极值点为:玉米芯浓度为3.824%(3.8%)，吐温－80浓度为0.265%(0.27%)，接种量为5.266%(5.3%)，此时模型预测的极大值为21.80U/mL。

图1 响应面法(X1，X2)立体分析图Fig.1 3D surface map of response surface(X1，X2)

2.5 回归模型的验证

在以上优化条件下进行验证实验，共进行5批次250mL摇瓶实验，取平均值为21.1U/mL。该结果与模型预测基本一致，表明所得的模型有一定的实验指导意义。

3 结论与讨论

现在许多研究工作显示在微生物培养基的优化工作中，合理地使用Plackett－Burman和响应面分析法，能取得良好的效果，可以使研究、生产者在更广泛的范围内考虑因素的组合。

图2 响应面法(X1，X3)立体分析图Fig.2 3D surface map of Response surface(X1，X3)

图3 响应面法(X2，X3)立体分析图Fig.3 3D surface map of Response surface(X2，X3)

本研究证明将Plackett－Burman筛选与响应面分析相结合对米曲霉ASPE0485所产β－葡萄糖苷酶的培养基进行优化，效果显著。确定显著影响因子为碳源、接种量和表面活性剂，通过最陡爬坡及Box－Benhnken响应面实验确定最佳发酵培养基配方为(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐温－80 0.27%和接种量5.3%;在此条件下发酵，得到酶活为21.1U/mL，比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。由此可知响应面法可快速有效且直观的选择实验设计中的最优化条件，能够降低开发成本、优化加工条件，为提高产品质量、解决生产过程中的实际问题提供了一种有效方法。本文选用的响应面分析法优化培养基，提高了发酵水平，为发酵优化方法提供一定的借鉴作用，为工业化发酵生产β－葡萄糖苷酶奠定了理论基础。

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Optimization and analysis of β－glucosidase production by Aspergillus oryzae in liquid cultures using response surface methodology

ZHU Jing1，WANG Qing－yan1，2，LIU Yan－jing2，SHE Nai－kun1，CHEN Gui－guang2，LIANG Zhi－qun2，*
(1.National Engineering Research Center for Non－food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China; 2.Life Science and Technology College，Guangxi University，Nanning 530005，China)

Response surface analysis was conducted on Aspergillus oryzae ASPE0485 to determine the optimal culture medium for β－glucosidase fermentation.The Box－Behnken and Plackett－Burman design was utilized to the response surface analysis to determine the optimal culture medium consistents(%，w/v)were as follow:corncob 3.8%、soya peptone 0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、tween－80 0.27%and inoculum size 5.3%.The β－glucosidase activity was 21.1U/mL under the optimal conditions，which was more 19.55%than the original strain activity(17.65U/mL).

Aspergillus oryzae;β－glucosidase;response surface analysis

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0215－04

β－葡萄糖苷酶(EC3，2，1，21)属于水解酶系，广泛地存在于自然界许多植物体及酵母、曲霉菌、木霉菌属、细菌等微生物体系内。它的作用是水解结合于未端、非还原性的β－D－糖苷键，同时释放β－D－葡萄糖和相应的配基。在纤维素的糖化作用中，β－葡萄糖苷酶的功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖［1］。β－葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员，而且由于其在纤维素酶组分中含量最少、活力普遍较低，成为纤维素酶解的主要瓶颈。因此，增强纤维素酶体系中β－葡萄糖苷酶的活力，是提高纤维素水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一。米曲霉是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会在1989年公布的40余种安全微生物菌种之一，已广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。本文采用响应面法(RSM)对米曲霉ASPE0485所产的β－葡萄糖苷酶的发酵培养基进行优化，从而提高β－葡萄糖苷酶产量，为规模化生产 β－葡萄糖苷酶提供理论基础［2－3］。

2011－07－11 *通讯联系人

朱婧(1983－)，女，硕士研究生，研究实习员，研究方向:发酵工程。

桂科攻(09YJ17SW02);桂科攻(1099070)。