米糟蛋白酶解制备生物肽及其抗氧化活性的研究

曲文娟，马海乐，贾俊强，潘忠礼

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013; 2.美国加州大学戴维斯分校生物与农业工程学院，美国戴维斯95616; 3.美国农业部西部研究中心，美国伯克利94710)

米糟蛋白酶解制备生物肽及其抗氧化活性的研究

曲文娟1，马海乐1，贾俊强1，潘忠礼2，3

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013; 2.美国加州大学戴维斯分校生物与农业工程学院，美国戴维斯95616; 3.美国农业部西部研究中心，美国伯克利94710)

为了高值化利用米糟资源，以米糟蛋白为原料通过酶解法生产一种高效、低毒的天然米糟抗氧化肽。实验结果表明:7种蛋白酶中，中性酶为最佳酶选，其最佳酶解条件为:米糟蛋白质量浓度(S)为10g/100mL，中性酶浓度(E/S，质量分数)为8%，pH为6.0，温度为60℃，时间为30min。在该最佳酶解条件下，米糟生物肽的得率为18.50%，水解度为2.84%，DPPH·(1，2－二苯代苦味肼基自由基)清除率为90.10%。该米糟生物肽具有较强的DPPH和羟自由基清除能力，其IC50值(抗氧化活性为50%时所对应的米糟生物肽质量浓度)分别为1.136、0.169g/L，还具有较强的还原能力和Fe2+螯合能力(IC50值为2.127g/L)。由此得出，米糟蛋白是一种很好的米糟抗氧化肽生产原料，且该生物肽是一种较为理想的天然抗氧化剂产品。

米糟蛋白，抗氧化剂，酶解法，生物肽，抗氧化活性

自由基理论认为，随着年龄增长或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下降，人体在生理代谢过程中产生的含氧自由基不能及时清除，积累过多的自由基将与机体内的一些生物大分子发生反应生成大量氧化物或过氧化物可导致许多慢性病，如动脉硬化症［1］、关节炎、癌症［2］及其它变性疾病［3］。因此，寻找高效、低毒的抗氧化剂一直是近年来研究者们关注的课题。天然抗氧化肽因具有高效清除自由基且安全性高的优势，引起了人们的广泛关注。目前已有一些关于天然抗氧化肽的研究，如酪蛋白抗氧化肽、油茶饼粕抗氧化肽、花生抗氧化肽等，且研究主要集中在抗氧化肽的制备和活性方面［4－8］。国内外也已有关于大米抗氧化肽的研究［9－12］，多是以大米作为生产原料，对大米淀粉加工后的副产物－米糟资源的高效利用较少，且主要侧重于制备和功能性方面的研究，对其抗氧化活性评价指标的全面系统研究较少。我国的稻谷年产量为1.85亿t，居世界首位，大米资源极其丰富。米糟作为大米淀粉加工后的主要副产物，蛋白质含量高达70%，但因其色泽和水溶性较差，主要被用作廉价动物饲料或直接扔弃，造成了严重的资源浪费。因此，为了高值化利用米糟蛋白资源生产出一种高效、低毒的天然米糟抗氧化肽，本实验通过酶筛选和正交优化实验获得了米糟生物肽的最佳酶解制备工艺条件。同时，通过多项抗氧化指标(DPPH·清除率、·OH清除率、Fe2+螯合率和还原能力)系统表征了米糟生物肽的抗氧化活性。本文采用了酶解法制备米糟抗氧化肽，以期达到安全性高，生产条件温和，可定位生产特定肽的目的，为米糟资源的有效利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糟蛋白原料 纯度为70%，嘉吉饲料镇江有限公司;1，2－二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) Sigma公司;碱性酶和胰蛋白酶 Novozymes公司;风味酶、中性酶、复合酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，7种蛋白酶的性能见表1;其他化学试剂 均为分析纯。

WFJ7200型分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;DZF－6020型真空干燥箱 深圳市爱特尔电子科技有限公司;SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;SHZ－88A型往复式水浴恒温振荡器 太仓市实验设备厂;LD5－2A型离心机 北京医用离心机厂;PHS－25A型数字pH计 上海大普仪器有限公司;SK－Ⅰ型快速混匀器 江苏金坛医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酶筛选实验 称取米糟蛋白5g、酶0.25g，加水至100mL，在各酶最适酶解条件下水解2h，然后在100℃下灭酶20min，在3500r/min下离心，取上清液分别测定水解度、DPPH·清除率和IC50值。

表1 7种蛋白酶的最适酶解条件和酶活性Table 1 Optimum enzymolysis conditions and enzymatic activities of seven protease

1.2.2 工艺优化实验 根据预实验结果发现，酶解时间对实验结果影响不显著，故将酶解时间固定为30min。选取米糟蛋白质量浓度(S)、中性酶浓度(E/S，质量分数)、酶解pH、酶解温度为4个考察因素，对每个因素选取4个水平，进行L16(45)正交实验，因素水平和实验设计见表2和表3，以DPPH·清除率为考察指标，对酶解条件进行优化实验。

表2 正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 分析实验

1.2.3.1 水解度的测定 水解度(degreeof hydrolysis，DH)是按文献［13］的方法测定得。水解度即米糟蛋白酶解过程中，水解的肽键数与总肽键数之间的比值，用以表征米糟蛋白水解的程度。水解度(质量分数，%)的计算公式如下:

式中:DH－水解度，%;W1－米糟生物肽中游离氨基氮含量(采用pH－stat法测定)，g/mL;W2－米糟蛋白质量浓度，g/mL;5.93－米糟蛋白的换算系数。

1.2.3.2 DPPH·清除率的测定 对文献［14］的方法进行适当调整，移取2mL米糟生物肽溶液置于试管中，加入2mL 0.04g/L的DPPH乙醇溶液，混合均匀，在室温下反应20min，3500r/min离心10min，取上清液在517nm处测吸光值为Ai(样品组的吸光值);另各取2mL上述浓度的米糟生物肽溶液置于试管中，再加入2mL无水乙醇，混合均匀，在室温下反应20min，3500r/min离心10min，取上清液在517nm处测吸光值记为Aj(空白组的吸光值);以2mL双蒸水和2mL 0.04g/L DPPH乙醇溶液作为对照，其吸光值记为Ah(对照组的吸光值)。以维生素C作为对照样品。DPPH·清除率(%)的计算公式如下:

1.2.3.3 羟自由基(·OH)清除率的测定 对文献［15］的方法进行适当调整，移取2mL米糟生物肽溶液置于试管中，依次加入2mL 6mmol/L的硫酸亚铁溶液(FeSO4)、2mL 6mmol/L的双氧水溶液(H2O2)，混合均匀，在室温下反应10min，再加入2mL 6mmol/ L水杨酸溶液，混合均匀，在室温下反应30min，取上清液在510nm处测其吸光值记为Ae(样品组的吸光值);当用双蒸水代替水杨酸溶液时测得的吸光值记为Af(空白组的吸光值);对照组以双蒸水代替米糟生物肽溶液测得的吸光值记为Ad(对照组的吸光值)。以维生素C作为对照样品。羟自由基清除率(%)的计算公式如下:

1.2.3.4 Fe2+螯合率的测定 对文献［16］的方法进行适当调整，移取1mL米糟生物肽溶液置于试管中，依次加入3.7mL去离子水、0.1mL 2mmol/L氯化亚铁溶液(FeCl2)、3.7mL 5mmol/L亚铁嗪溶液(Ferrozine)，混合均匀，在室温下反应10min，取上清液在562nm处测其吸光值记为Aa(样品组的吸光值);对照组以去离子水代替米糟生物肽溶液测得的吸光值记为Ab(对照组的吸光值)。以乙二胺四醋酸(EDTA)作为对照样品。Fe2+螯合率(%)的计算公式如下:

1.2.3.5 还原能力的测定 还原能力是按文献［17］的方法测定。吸光值越高，代表米糟生物肽的还原能力越强。同时以维生素C作为对照样品。

1.2.3.6 IC50值的测定 IC50值(半抑制浓度)代表抗氧化活性为50%时所对应的米糟生物肽质量浓度(g/L)。配制不同浓度的米糟生物肽溶液，测定其各自的抗氧化活性，得出米糟生物肽浓度与抗氧化活性的关系方程，从而计算抗氧化活性为50%时所对应的米糟生物肽质量浓度即为IC50值。IC50值越低，表明米糟生物肽的抗氧化活性越强。

所有样品均取三个平行样进行分析测试，实验数据均记录其平均值。采用Excel软件对DPPH·清除率进行Anova分析用来判断数据之间是否存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 酶筛选实验结果

本文对7种常用蛋白酶对米糟蛋白的酶解效果分别进行评价，实验结果见图1。

图1 各酶解产物的DPPH·清除率、水解度和IC50值Fig.1 DPPH·scavenging rate，degree of hydrolysis and IC50value of each hydrolysate

从图1可以看出，米糟蛋白(浓度为5g/100mL)经7种蛋白酶水解制备的米糟生物肽均具有一定的DPPH·清除效果。这是因为米糟蛋白被蛋白酶彻底水解成小分子量片段的多肽(1000～5000u)，该多肽含有大量的末端疏水性氨基酸［18］，如Trp、Tyr、Phe和Pro，经之前研究证实该多肽具有抗氧化的功效［19］。因此可以说明米糟蛋白经蛋白酶水解制备的米糟生物肽具有抗氧化活性，可以高效清除DPPH·。

从图1还发现，米糟蛋白经胰蛋白酶水解所得的生物肽具有最高的水解度，米糟蛋白经中性酶水解所得的生物肽对DPPH·的清除率最高，米糟蛋白经木瓜蛋白酶水解所得的生物肽具有最低的IC50值。综合考虑水解度、DPPH·清除率和IC50值评价指标，发现经中性酶水解制备的米糟生物肽具有较优的水解度、DPPH·清除率和IC50值，故将中性酶作为最佳酶选，用于下一步的米糟蛋白酶解条件优化实验。

2.2 工艺优化实验结果

测定优化实验中各米糟生物肽的DPPH·清除率，实验结果见表3。

表3 正交实验设计及结果Table 3 Design and result of orthograpbic experiment

从表3的极差分析结果可以看出，因素主次顺序为:A＞D＞B＞C，最优方案为A4B4C2D2。由此得出:米糟蛋白质量浓度对米糟生物肽的DPPH·清除率影响最大，其次是酶解温度、中性酶浓度、酶解pH。同时获得了米糟生物肽的最佳酶解制备条件为:米糟蛋白质量浓度(S)为10g/100mL，中性酶浓度(E/S，质量分数)为8%，pH为6.0，温度为60℃，时间为30min。

对正交实验数据进行方差分析，分析结果如表4所示。

从表4中发现，米糟蛋白质量浓度和酶解温度因素对结果影响很显著，而中性酶浓度和酶解pH对结果影响不显著(显著性考察水平为0.05)，方差分析结果与极差分析结果一致。由于最优方案并未出现在正交表中，所以对最优组合进行3次重复验证实验，验证实验结果表明米糟生物肽产品的DPPH·清除能力重现性良好。同时在该最佳条件下，米糟生物肽的得率为18.50%(质量分数)，水解度为2.84%，DPPH·清除率为90.10%。

表4 正交实验方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment

2.3 米糟生物肽抗氧化活性评价结果

2.3.1 米糟生物肽清除DPPH·的效果分析 DPPH·是一种对人体有害的自由基。因此目前以DPPH·清除率作为评价物质是否具有抗氧化活性的指标之一［14］。本文对米糟生物肽和维生素 C(对照)的DPPH·清除能力分别进行评价，实验结果如图2所示。

图2 米糟生物肽(a)和维生素C(b)的DPPH·清除率Fig.2 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on DPPH radical

从图2可以看出，随着米糟生物肽和维生素C浓度的增大，其对DPPH·的清除率均呈现增加的趋势。通过对它们各自浓度与DPPH·清除率之间进行拟合，得到各自的回归方程，由此计算得到米糟生物肽的 IC50值为 1.136g/L，维生素 C的 IC50值为0.005g/L，且米糟生物肽的 IC50值约为维生素 C的214倍。

2.3.2 米糟生物肽清除羟自由基的效果分析 对米糟生物肽和维生素C(对照)的羟自由基清除能力分别进行评价，实验结果见图3。

从图3可以看出，米糟生物肽和维生素C浓度的增加均对羟自由基清除率起促进作用。通过软件拟合浓度与羟自由基清除率之间的关系，得到各自的回归方程。结果得到:米糟生物肽的 IC50值为0.169g/L，维生素C的IC50值为0.086g/L，米糟生物肽的IC50值约为维生素C的1.96倍。

图3 米糟生物肽(a)和维生素C(b)的羟自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on hydroxyl radical

2.3.3 米糟生物肽对Fe2+螯合能力的效果分析

Fe2+离子可以通过Fenton反应分解过氧化物产生大量的自由基，导致人类产生一些心血管疾病。同时，Fe2+还被认为是产生氧自由基和促进油脂过氧化的主要原因之一［20］。本文对米糟生物肽和EDTA(对照)的Fe2+螯合能力分别进行评价，实验结果如图4所示。

图4 米糟生物肽(a)和EDTA(b)的Fe2+螯合率Fig.4 Chelation rate of rice dreg peptide(a) and EDTA(b)on Fe2+

由图4可见，随着米糟生物肽和EDTA浓度的增加，其对Fe2+螯合能力均呈现增加的趋势。由此得出，米糟生物肽可以降低Fe2+的浓度，从而预防氧化损伤。通过软件拟合浓度与Fe2+螯合率之间的关系，得到各自的回归方程。结果得出:米糟生物肽的IC50值为2.127g/L，EDTA的IC50值为0.034g/L，米糟生物肽IC50值约为EDTA的62.9倍。

2.3.4 米糟生物肽还原能力的效果分析 对米糟生物肽和维生素C(对照)的还原能力分别进行分析，实验结果见图5。

图5 米糟生物肽和维生素C的还原能力Fig.5 Reduction ability of rice dreg peptide and vitamin C

在还原能力分析中得知:样品在700nm处的吸光值越大，代表样品的还原能力越大［17］。因此，我们得出:随着米糟生物肽浓度的增大，其还原能力也进一步增大;维生素C与米糟生物肽表现出相似的规律，但是增加速率较其快。

3 结论

3.1 通过酶筛选和酶解工艺优化实验，对米糟蛋白酶解制备米糟生物肽的工艺条件进行优化。结果表明:中性酶为最佳酶选，其最佳酶解条件为:米糟蛋白质量浓度(S)为10g/100mL，中性酶浓度(E/S，质量分数)为8%，pH为6.0，温度为60℃，时间为30min。在该最佳酶解条件下，米糟生物肽的得率为18.50%，水解度为 2.84%，DPPH· 清除率为90.10%。由此得出:米糟蛋白是一种很好的米糟生物肽生产原料。采用上述酶解工艺条件以米糟蛋白为原料制备米糟生物肽，经实践扩大量工艺生产发现，产品品质重现性良好，应用经济性也较好。

3.2 对米糟生物肽的抗氧化活性进行评价，结果表明:米糟生物肽具有较强的DPPH·清除能力，其IC50值为1.136g/L;米糟生物肽具有较强的羟自由基清除能力，其IC50值为0.169g/L;米糟生物肽对Fe2+离子具有较强的螯合作用，其IC50值为2.127g/L;米糟生物肽也表现出较强的还原能力。由此得出:米糟生物肽具有一定程度的抗氧化活性，且具有低毒的优势，是一种较为理想的天然抗氧化剂产品，可以用作人工合成抗氧化剂的替代品。

3.3 与维生素C和EDTA对照相比，米糟生物肽的抗氧化活性相对较弱，考虑到米糟生物肽的纯度对其抗氧化活性影响很大，因此非常有必要对米糟抗氧化肽进一步纯化。同时，对米糟生物肽的结构进行表征，建立其结构与抗氧化活性的关系，进一步提高其抗氧化活性，以期生产出高效的米糟抗氧化肽产品。

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Study on biological peptide preparation from rice dreg protein by enzymatic hydrolysis and its antioxidative activity

QU Wen－juan1，MA Hai－le1，JIA Jun－qiang1，PAN Zhong－li2，3
(1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China; 2.Department of Biological and Agricultural Engineering，University of California，Davis 95616，America; 3.United States Department of Agriculture West Regional Center，Berkeley 94710，America)

In order to high－valued utilize the rice dreg resources，a natural antioxidative peptide with high effective and low toxic properties was produced from rice dreg protein by the enzymatic hydrolysis method.The results showed that the neutral enzyme was optimum among seven protease.The optimum enzymatic hydrolysis conditions were 10g/100mL rice dreg protein concentration(S)，8%neutral enzyme concentration(E/S，w/w)，pH 6.0，temperature of 60℃and time of 30min.Under the optimum condition，rice dreg biological peptide had the yield of 18.50%，degree of hydrolysis of 2.84%and DPPH· scavenging rate of 90.10%.The results also showed that rice dreg biological peptide had strong scavenging capabilities on DPPH·and hydroxyl free radicals with IC50values of 1.136 and 0.169g/L.Moreover，the rice dreg biological peptide had strong reducing capability and chelating Fe2+ability with IC50value of 2.127g/L.It was concluded that rice dreg protein was a good source for producing antioxidative peptide and the rice dreg biological peptide was an ideally natural antioxidants.

rice dreg protein;antioxidants;enzymatic hydrolysis;biological peptide;antioxidative activity

TS210.9

A

1002－0306(2012)08－0183－06

2011－07－26

曲文娟(1980－)，女，博士，讲师，研究方向:功能食品。

江苏大学高级技术人才科研启动基金项目(10JDG121);江苏大学博士后基金项目(1143002027);江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD);科技部国际合作项目(2009DFA32000)。