表面印迹法制备链霉素分子印迹聚合物及其性能研究

杨 眉，侯长军，李贤良，霍丹群，黄清菁

(1.重庆大学生物工程学院，重庆400044;2.重庆出入境检验检疫局，重庆400020)

表面印迹法制备链霉素分子印迹聚合物及其性能研究

杨 眉1，侯长军1，李贤良2，霍丹群1，黄清菁1

(1.重庆大学生物工程学院，重庆400044;2.重庆出入境检验检疫局，重庆400020)

利用硅胶颗粒为基质，在其表面接枝硅烷化试剂3－甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ－MPS)，进行硅烷化处理后，以链霉素为模板分子，甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，N，N'－亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂在颗粒表面合成分子印迹层，制备得到链霉素分子印迹聚合物(MIPMs)和空白聚合物(NMIPMs)，并采用静态平衡结合法借助高效液相色谱－蒸发光散射(HPLC－ELSD)研究了聚合物对模板分子链霉素的吸附能力、结合动力学和选择特性。扫描电镜观察和红外光谱分析结果表明表面印迹层已经成功合成;吸附实验结果表明，MIPMs比NMIPMs对链霉素具有更强的吸附特性和更好的选择性。

链霉素，分子印迹，表面印迹，聚合物，吸附性能

动物源性食品中兽药残留问题是近年来国际社会关注的公共卫生热点之一，受到人们的普遍重视。氨基糖苷类兽药在预防和控制动物疫病中发挥着重要的作用，但临床已经证明此类药物具有耳毒性和肾毒性，所以其在动物源性食品中的残留会给人体健康带来严重的危害。因此，发展快速、准确、灵敏的检测残留方法显得尤为重要，也成为当前研究的热点问题。目前，动物源性食品中氨基糖苷类药物残留的检测方法主要有微生物检测法、免疫学检测法和大型仪器检测法等等。微生物检测法虽然价格便宜，操作简单，适用于样品的大批量筛选，但准确度和灵敏度较低，检测限达不到要求，且测定结果误差较大。免疫分析法材料生产周期长，成本较高，易产生假阳性结果，需要进行确证［1］。因氨基糖苷类抗生素紫外吸收较弱，灵敏度低，用高效液相色谱法(HPLC)测定时通常需要衍生化后用荧光检测器进行测定，操作繁琐。液相色谱－串联质谱联用法(LC－MS)灵敏度高，选择性和准确性好，但仪器昂贵、成本高，对样品前处理的要求很高。分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)是指制备对某一特定的模板分子具有选择性的分子印迹聚合物(molecular imprinting polymer，MIP)的技术，具有结构预定性、特异识别性和广泛实用性等特点。分子印迹固相萃取技术由于具有对痕量组分有较强特异性的分离和富集能力，可以提高药物残留净化的选择性和净化效果，在食品中兽药残留检测的前处理方面有着巨大的发展应用潜力［2－5］。链霉素是一种广谱的氨基糖苷类抗生素，主要作用于细胞的核糖体，通过抑制细菌蛋白质的生物合成而呈现杀菌作用，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌特别是结核分枝杆菌具有显著的抗菌活性，在畜牧业上得到了广泛应用。但是，链霉素作为兽药和饲料添加剂长期使用会导致动物体内药物的蓄积，并通过食物链进入人体及生态系统，危害人类健康和污染环境。针对目前HPLC及LC－MS检测动物源性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留中样品前处理和分析过程复杂繁琐，普通的固相萃取材料对目标物的特异性净化能力不强，对于痕量残留物质的富集倍数不高等问题与不足，实验采用分子印迹技术制备得到链霉素分子印迹聚合物，并对其吸附性能进行系统评价，以期为进一步作为固相萃取填料提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

硫酸链霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素 纯度均大于98.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲基丙烯酸(MAA)、N，N'－亚甲基双丙烯酰胺(MBA) 美国Aldrich－Sigma公司;层析硅胶 青岛海洋化工厂; 3－甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ－MPS) 南京立派化工有限公司;过硫酸铵、氢氟酸、四氢呋喃、无水乙醇 重庆川东化工有限公司;双重去离子水MilliQ纯水纯化系统。

Waters Acquity型高效液相色谱系统，Alltech 2000型蒸发光散射检测器，TESCAN VEGA LMU型扫描电子显微镜，Spectrum GX型傅立叶变换红外光谱仪，SHA－C型往复式水浴恒温振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 硅胶的活化及硅烷化改性 称取适量干燥硅胶用1%氢氟酸浸泡48h，以除去其表面可能存在的无机杂质，并增加硅胶表面的活化羟基数目［6］，有利于下步反应进行硅烷化接枝。用去离子水多次离心洗涤，直至上清液近中性。干燥，称重。

称取干燥已活化的干燥硅胶1g置于单口烧瓶中，加入乙醇/水(4∶1，V/V)的混合溶液，搅拌且超声分散;另取10mL γ－MPS加入乙醇/水(4∶1，V/V)的溶液中，超声水解1h后，倒入上述烧瓶，升温至70℃，恒温电磁搅拌反应12h;反应结束后，冷却至室温，分别用无水乙醇和去离子水多次离心洗涤，直至完全去除未反应的硅烷化试剂。干燥，称重。

1.2.2 链霉素分子印迹聚合物制备 称取1.0g硅烷化后的硅胶，放入40mL四氢呋喃/水(7∶1，V/V)混合溶液中分散;将0.04mmol硫酸链霉素和0.16mmol MAA溶于30mL四氢呋喃/水(7∶1，V/V)溶液中，超声混合均匀后在4℃冰箱中放置过夜形成预聚合物，再加入0.8mmol MBA混合，加至上述含硅胶的溶液中，通N2搅拌30min;加入少量过硫酸铵，保持搅拌和通N2，在65℃温度下反应24h;反应结束后，冷却至室温，分别用无水乙醇和去离子水多次离心洗涤，直到液相色谱检测洗脱液中不含链霉素分子为止。40℃真空干燥备用［7］。空白印迹聚合物(NMIPMs)以同样方法制备，只是不加入模板分子。

1.2.3 形貌和成分表征 分别称取25mg层析硅胶和25mg MIPMs置于小烧杯中，加入1mL乙醇后超声分散10min，各取微量于清洁处理过的硅片上，干燥后喷金，用SEM对两种样品进行形貌表征。

以KBr压片制备样品，分别检测 MIPMs和NMIPMs的红外光谱图。

1.2.4 动态吸附性能研究 分别称取11组等量的MIPMs和NMIPMs各30mg，置于25mL磨口锥形瓶中，加入15mL的1.5μg/mL的硫酸链霉素水溶液，25℃条件下进行振荡吸附0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24h，将各混合液转入离心管，离心，上清液用HPLC－ELSD测定［8］，分析MIPMs和NMIPMs对链霉素的动态吸附情况。根据吸附前后溶液中链霉素浓度的变化，由式(1)计算出聚合物对链霉素的吸附量Q(μg/mg)，平行3次取平均值，绘出吸附量Q与振荡吸附时间关系的动力学曲线。

式中，C0、Cv分别表示吸附前、后溶液中链霉素的浓度(μg/mL);V为链霉素水溶液的加入量(mL);m为聚合物的加入量(mg)。

1.2.5 静态吸附性能研究 称取6组等量的MIPMs和NMIPMs各30mg，分别置于25mL磨口锥形瓶中，并依次加入浓度为0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0μg/mL链霉素水溶液15mL，25℃条件下进行振荡吸附24h，将各混合液转入离心管，离心，上清液用HPLC－ELSD测定。再利用吸附前后的浓度差值，即可计算出MIPMs和NMIPMs的平衡吸附量Q。

1.2.6 选择吸附性能研究 称取3组等量MIPMs和NMIPMs各30mg，分别置于25mL磨口锥形瓶中，在第1组锥形瓶中加入浓度为1.5μg/mL硫酸链霉素水溶液，第2组锥形瓶中加入浓度为1.5μg/mL硫酸新霉素水溶液，第3组锥形瓶中加入浓度1.5μg/mL硫酸庆大霉素水溶液，后续步骤同上述吸附实验操作。

2 结果与讨论

2.1 形貌表征

图1为硅胶颗粒和MIPMs的SEM图。从图2可以看出，MIPMs的粒径比硅胶颗粒的粒径稍大些，表面明显覆盖有凹凸不平的聚合物层，外观形貌的变化证实了表面印迹法的可行性，实验成功制备得到了以硅胶为基质的分子印迹聚合物颗粒。

图1 硅胶颗粒(a)和链霉素分子印迹聚合物(b)的SEM图Fig.1 Scanning electron microscopic(SEM)images of(a) SiO2particles and(b)MIPMs

2.2 化学成分分析

未洗脱分子印迹聚合物MIPMs和NMIPMs的红外光谱对比如图2所示。从图2可以看出，MIPMs中明显多出特征吸收峰3424cm－1，它是链霉素中多羟基的伸缩振动峰，另一处新吸收峰1658cm－1为链霉素中酰胺基团的伸缩振动峰，由此可以说明未洗脱的MIPMs中存在链霉素分子，实验成功合成了分子印迹聚合物。

图2 NMIPMs(a)和未洗脱的MIPMs(b)的红外光谱图Fig.2 IR spectra of NMIPMs(a)and MIPMs(b)

2.3 吸附动力学研究

配制系列标准浓度的硫酸链霉素溶液，利用HPLC－ELSD进行检测，得到链霉素的标准工作曲线，如图3所示，在0.05～2.5μg/mL范围内溶液浓度与峰面积之间有良好的线性关系，其回归方程为Y= 245990X－14724，R2=0.9998。

吸附量Q与振荡吸附时间关系的动力学曲线如图4所示。从图中可以看出，MIPMs和NMIPMs对溶液中的链霉素均有一定程度的吸附，随着吸附时间的延长，对链霉素的吸附量逐渐增大。初始阶段吸附量增加较快，但后期吸附量的增加逐渐趋于平缓，到达16h后吸附量随时间延长而变化不大，因此可以确定吸附达到平衡的时间为16h。另外还可以明显地观察到，MIPMs的吸附量始终比NMIPMs的吸附量大，这是由于MIPMs经洗脱后表面产生大量印迹空穴，对链霉素产生稳定的特异性吸附，所以其吸附量远远大于NMIPMs表面非特异性的吸附量。

图3 链霉素的标准工作曲线图Fig.3 Standard curves of streptomycin

图4 MIPMs和NMIPMs的吸附动力学曲线Fig.4 Curve of adsorption dynamic of MIPMs and NMIPMs

2.4 平衡吸附量研究

MIPMs和NMIPMs对不同初始浓度链霉素的吸附量如图5所示，当起始浓度为0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0μg/mL时，MIPMs和NMIPMs的吸附量都随链霉素浓度的增加而增加，但NMIPMs对链霉素的平衡结合量明显低于MIPMs。这是因为NMIPMs表面暴露的游离－COOH等其他基团会对链霉素产生不稳定的非特异性吸附;但MIPMs经洗脱后表面产生大量印迹空穴，对链霉素产生稳定的特异性吸附，其结合量远大于NMIPMs表面产生的非特异性吸附，因此MIPMs对链霉素的结合量明显大于NMIPMs。

图5 MIPMs和NMIPMs的等温吸附曲线Fig.5 Binding isotherms of MIPMs and NMIPMs at different concentrations of streptomycin

根据上述吸附量数据，通过 Scatchard模型对MIPMs的吸附特性进行分析:

式中，Q为吸附平衡时MIPMs对链霉素的结合量(μg/mg)，F为吸附平衡时溶液中游离链霉素的浓度(μg/mL)，Qmax为最大表观结合量，KD为结合位点的平衡离解常数。

将实验中得到的MIPMs对链霉素的结合量式(2)以游离比(Q/F)对Q作图，得到图6所示Scatchard分析图，非线性关系表明存在不等价的结合位点。在图6中存在两个明显的部分分别有良好的线性关系，证明在研究的浓度范围内，MIPMs主要存在两类不同的结合位点与链霉素进行作用。对2个线性部分分别进行拟合，由斜率和截距可分别求得高亲和位点的解离常数KD1=0.625μg/mL，最大表观结合量Qmax1=1.254μg/mg，低亲合位点解离常数为KD2=0.861μg/mL，最大表观结合量Qmax2=0.829μg/mg。

图6 MIPMs的Scatchard分析图Fig.6 Scatchard plots to estimate the binding nature of MIPMs

2.5 选择吸附性能研究

图7所示为MIPMs和NMIPMs分别与链霉素、新霉素和庆大霉素三种氨基糖苷类抗生素的结合量比较。其中，NMIPMs由于表面产生有非特异性吸附，分别对这三种化合物有一定程度的吸附，但是吸附量均小于MIPMs对其的吸附量;MIPMs对三种化合物的吸附量大小依次为:链霉素＞新霉素＞庆大霉素。链霉素、新霉素和庆大霉素三种氨基糖苷类抗生素的分子结构见图8，从图8中可以看出，新霉素的结构和位点比起庆大霉素与链霉素更为接近，因而吸附量次之。MIPMs对链霉素的吸附量最大，这说明MIPMs表面对链霉素形成了从三维空间和结合位点上可特异性结合的识别空穴，具有较好的选择性能。

图7 MIPMs及NMIPMs对链霉素、新霉素和庆大霉素的吸附量对比图Fig.7 Absoption capacity of MIPMs and NMIMPs for different substrates

3 结论

本文以硅胶颗粒为基质，利用表面印迹聚合法制备了链霉素分子印迹聚合物(MIPMs)。扫描电镜和红外分析结果证实了表面印迹聚合层已经成功合成。吸附动力学研究结果显示吸附达到平衡的时间为16h，而静态吸附研究结果表明MIPMs对链霉素的吸附量比NMIPMs更大，并通过Scatchard分析得到，MIPMs主要存在两类不同的结合位点与链霉素进行作用，高亲和位点的解离常数KD1=0.625μg/mL，最大表观结合量Qmax1=1.254μg/mg，低亲合位点解离常数为 KD2=0.861μg/mL，最大表观结合量 Qmax2= 0.829μg/mg，并且与新霉素和庆大霉素相比，MIPMs对链霉素具有更好的选择吸附性能。

图8 链霉素、新霉素和庆大霉素的分子结构示意图Fig.8 Structural formula of streptomycin，neomycin and gentamicin

［1］Chen Y Q，Shang Y H，Li X M，et al.Development of an enzyme－linked immunoassay for the detection of gentamicin in swine tissues［J］.Food Chemistry，2008，108(1):304－309.

［2］Shi X，Meng Y，Liu J，et al.Group－selective molecularly imprinted polymer solid－phase extraction for the simultaneous determination of six sulfonamides in aquaculture products［J］. Joumal of Chromatography B，2011，879(15－16):1071－1076.

［3］Hu Y L，Liu R J，Li Y W，et al.Investigation of ractopamineimprinted polymer for dispersive solid－phase extraction of trace beta－agonists in pig tissues［J］.Journal of Separation Science，2010，33(13):2017－2025.

［4］Sun X，He X，Zhang Y，et al.Determination of tetracyclines in food samples by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography［J］.Talanta，2009，79(3):926－934.

［5］Kootstra P R，Kuijpers C J P F，Wubs K L，et al.The analysis of beta－agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMS screening［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529(1－2):75－81.

［6］王伟山，易红玲，郑柏存，等.甲基丙烯酸甲酯对纳米SiO2的表面接枝聚合改性研究［J］.化工新型材料，2009，37(9): 83－86.

［7］Ma J，Yuan L H，Ding M J，et al.The study of core－shell molecularly imprinted polymers of 17 β－estradiol on the surface of silica nanoparticles［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，26 (5):2791－2795.

［8］张雷.HPLC－ELSD法分析硫酸链霉素的含量［J］.中国抗生素杂志，2009，34(3):168－169.

Study on synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers of streptomycin by surface imprinting polymerization

YANG Mei1，HOU Chang－jun1，LI Xian－liang2，HUO Dan－qun1，HUANG Qing－jing1
(1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China; 2.Chongqing Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020，China)

Silicon dioxide(SiO2)particlesweretreated withsilane and theirsurface weregrafted with 3－(methacryloxypropyl)－trimethoxysilane(γ－MPS).Subsequently molecularly imprintedmembrane was synthesized on the surface of SiO2particles，where streptomycin was used as the template molecule，methacrylic acid(MAA)was used as functional monomer and N，N'－Methylenebisacrylamide(MBA)was used as cross linker. Finally，molecularly imprinted polymer(MIPMs)and non－molecularly imprinted polymer(NMIPMs)were prepared by surface imprinting polymerization.The morphology of MIPMs was characterized by means of scanning electron microscopy(SEM).Infrared spectra of MIPMs and NMIPMs demonstrated the components of them.The experimental results of isotherm binding of MIPMs and NMIPMs at different concentrations of streptomycin indicated that MIPMs absorbedmore substrates than NMIPMs.MIPMs also showedgoodselectivity for streptomycin through the isotherm binding test of two other different substrates which were neomycin and gentamicin.

streptomycin;molecularly imprinted;surface imprinted;polymer;absorption properties

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0155－04

2011－07－07

杨眉(1980－)，女，博士，讲师，研究方向:分析检测材料。

国家自然科学基金项目(31000425);中央高校基本科研业务费资助项目(CDJZR10230005);国家质检总局科研计划检验检疫领域项目(2011IK254);重庆大学大型仪器设备开放基金项目(2010063061)。