体外循环导致大鼠小肠微循环损伤的机制研究

吴海卫，许 飚，景 华，王常田，钱建军，董国华

体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)过程中非生理性血流可引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，造成各种器官功能损伤。小肠在SIRS发生发展中即是“靶”又是“源”，CPB后肠黏膜屏障功能的损害可以造成内毒素入血、肠道菌群易位，从而触发瀑布效应，甚至引起多脏器功能障碍，影响临床治疗效果［1－2］。CPB引起肠道损伤的机制尚不清楚，本研究采用大鼠CPB模型，用荧光活体显微镜技术对小肠微循环变化进行直接观察，定量分析肠壁血流灌注、血管通透性及白细胞附壁情况，探讨CPB后肠道损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组 采用450～550 g成年雄性SD大鼠，建立常温CPB模型［3－4］。简要步骤如下，大鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机辅助通气，吸入氧浓度100%。左股静脉置22G套管针，接微量输液泵，维持静脉通道;右侧颈动脉置24G套管针，连接动脉泵管，用于CPB动脉血泵入。右颈静脉置入带网状侧孔的16G穿刺导管，深入至右心房水平，引流静脉血入贮血槽。全身肝素化(500 IU/kg)后开始转流。静脉血由右房经颈静脉管依靠重力和虹吸引出，引流到位于心脏平面下方30 cm的开放贮血槽，经微型膜肺(广东科威医疗器械有限公司，气血交换面积0.05 m2，预充量4 ml)氧合，氧合血由小型蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司，BT00－300M型)泵入右颈动脉。预充液由8 ml贺斯和8 ml供体血液构成。在贮血槽和膜肺上方，用100W白炽灯照明加热，以维持肛温在36.5～38.3℃。逐渐增加流量，稳定于100～150 ml/(kg·min)，维持平均动脉压在60～80 mm Hg。转流60 min后，逐步降低灌注流量并停机，依次拔除各管道。缓慢输入贮血槽中的余血，维持循环稳定。继续辅助呼吸120 min并进行微循环观察。20只大鼠随机分为CPB组及对照组，每组各10只。两组动物手术操作相同，CPB组连接CPB装置并转流60 min，对照组同样连接装置并肝素化但不转流。

1.2 活体观察方法 在观察开始前，经股静脉分别注入异硫氰酸荧光素标记牛白蛋白(fluorescein isothiocyanate－bovine serum albumin，FITC －BSA)(5%，0.2 ml/100 g)和吖啶橙(0.2%，0.1 ml/100 g)，其中FITC－BSA可以使血浆着色，以显示肠壁毛细血管结构，吖啶橙可以标记体内白细胞，使其细胞核在镜下呈现为发光亮点。做腹部正中切口，将末段回肠连同肠系膜轻轻拉出腹外，逆肠系膜方向纵形切开肠管约1 cm，以6－0单丝线缝于四周，舒展、固定于载玻片，置于观察台，连续用37～38℃生理盐水表面灌流给肠壁保温、保湿。黏膜及黏膜下层由通过切口由内向外，浆膜层及肌层则直接从肠管外由外向内进行观察。采用荧光显微镜(上海2XC4TV型)进行活体观察，用100W汞灯分别通过I2/3(绿色，波长530～560 nm)和 N2(兰色，波长450～490 nm)滤色板顶部照明。分别于CPB前(T1)、CPB 30 min(T2)、CPB 60 min(T3)、CPB 后60 min(T4)、CPB后120 min(T5)对小肠微循环状态进行显微观察，选定有代表性的4个不交叉区域经行各项指标检测，通过摄影、摄片记录有关图像资料，用Image J图像分析系统做评估。

1.3 指标检测

1.3.1 微循环血流动力学指标 选择无分枝、长度100μm、直径30μm左右的小动脉，测量其直径变化;用逐祯回放分析技术，测量黏膜下层收集静脉中的红细胞流速;测量观察区域内荧光灌注毛细血管长度，分别计算肌层、黏膜层单位面积FITC－BSA灌注毛细血管的长度，即功能毛细血管密度(functional capillary density，FCD)，FCD 值以单位面积FITC－BSA灌注毛细血管的长度表示(/cm)。

1.3.2 毛细血管通透性 FITC－BSA分子量大，正常情况下不能通透血管壁而位于血管腔内，当毛细血管通透性增加时，FITC－BSA可穿过血管壁进入组织间隙，使血管周围出现散在的不规则斑片状荧光。利用计算机图像处理技术，将其转为255灰阶图时，可以表现为灰度值增加，其增加幅度与FITC－BSA的漏出程度呈正相关。通过测定微血管周围的灰度值变化，可以定量了解血管壁的通透性情况，灰度值越高，则表示组织间的大分子物质越多，血管通透性就越大。

1.3.3 白细胞浸润情况 于高倍视野下找到黏膜下层清晰的毛细血管后微静脉，通过摄像系统记录白细胞的流动状态。将静止于血管内皮＞30 s和游走于血管外但仍在小血管旁的白细胞认定为附壁状态，对其计数，并计算100μm长度血管的附壁白细胞数。

2 结果

2.1 小动脉直径 小动脉直径自CPB开始后开始逐步下降，到观察结束时最为明显，从(30.8±3.6)μM降至(20.6 ±3.7)μm，差异显著(P ＜0.001)，这种血管收缩与小血管的自律运动无关，见图1。

2.2 小静脉血流速度 CPB开始后小静脉内血流速度减慢，随着CPB时间的延长，血流速度进一步降低。在T4和T5时小静脉血流速度仍持续降低，从T1时的(1.38±0.08)mm/s降为至 T5时的(0.44 ±0.06)mm/s，见图2。

2.3 功能毛细血管密度 对照组黏膜层毛细血管网丰富，绒毛内小血管细而迂曲，结构清晰;肌层毛细血管网在正常情况下呈规则矩形，毛细血管网丰富，显影清晰，见图3A。CPB状态下可见到明显的血管充盈减少，并有血管边缘模糊表现;转流后120 min FITC－BSA灌注血管影明显减少，并有相互之间的交通中断现象，见图3B。对照组肌层和黏膜层FCD值随时间的延长无明显变化，而CPB后则逐渐减少，至CPB后120 min时分别由从CPB前(511±17)/cm和(221±13)/cm降为(150±17)/cm和(64 ±7)/cm，差异显著(P ＜0.001)，见图4。

2.4 毛细血管通透性 对照组术后120min毛细血管轮廓清晰，FITC－BSA局限于血管内，血管周围背影黑暗，见图5A。CPB转流开始后，随时间延长可以见到逐步增多的血管外透亮区，在小肠黏膜层绒毛微血管和黏膜下层毛细血管后微静脉中尤为明显，至观察结束时，个别小血管结构变得模糊不清，边界难以确认，见图5B。定量分析则表现为小血管周围灰度值的逐步增加，由开始时的(142±7)升至实验结束时的(220±13)，有显著统计学差异 (P＜0.001)，表明CPB后小血管通透性增加。见图6。

2.5 白细胞浸润情况 对照组毛细血管内很少见到附壁白细胞，毛细血管内偶见被吖啶橙染亮的白细胞颗粒，见图7A，箭头所示为停留于血管边缘的白细胞，在吖啶橙染色下呈现桔红色颗粒;而CPB组大鼠在转流120 min后，附壁的白细胞数目明显增加，以黏膜下层小静脉内最为突出，可见到许多的白细胞亮点聚集于小血管内及血管周边，见图7B。定量分析显示白细胞附壁数由CPB前(2.8±1.3)个/100 μM升至(30.3±1.3)个/100 μm，差异显著(P ＜0.001)，见图8。

3 讨论

限于伦理道德方面的制约，对CPB所致胃肠道损伤及其在术后全身炎症反应中作用的研究，在人体上难以深入，大多限于临床经验总结或间接测定，如:对术后消化系统并发症的分析、Doppler超声腹内血管血流测定、动脉－胃黏膜pHi测定等，从而推断胃肠道缺血及黏膜损伤程度，无法做到直接、定量分析，进一步的研究必须依赖适当的动物模型［4－5］。本实验建立大鼠CPB模型，采用活体荧光显微镜技术，对小肠微血管形态、管壁结构完整性及血管内的细胞运动状态进行直接、定量观察和分析研究。过去的研究常采用肠系膜作为微循环观测对象，然而，肠系膜与肠壁内的微血管在结构分布和血流状态上存在很大差别，且肠壁各层之间也有明显不同［6－7］，因此，必须对肠壁各层(包括绒毛层、黏膜层、黏膜下层及肌层等)微循环直接观测，才是判断其损伤程度最直观、有效的方法。

通过上述方法，我们发现，CPB可造成肠道缺血、血管通透性增加和炎性细胞浸润等病理现象。CPB后小动脉管径变细，伴随着血流速度减慢，导致肠壁血供减少、灌注不足;FCD进行性下降，到观察结束时，大约只有转流前的30%，表明肠道存在血流重新分布，肠壁缺血的程度严重;白蛋白的外溢，显示血管壁通透性增加，屏障功能受损，而周围组织的水肿形成，可以进一步加重微循环损害;小静脉内聚集的附壁白细胞，可能是最早参与炎症反应的活化细胞，它们产生、释放各种炎性介质，破坏血管内皮完整性，加重液体外渗，并在随后的病理改变中伴演重要角色。研究还发现，毛细血管和黏膜下收集静脉的改变最早、最明显，是CPB损伤中最易受影响的结构单元。而转运毛细血管减少和腔内淤滞，可以导致小肠肌层毛细血管灌注和营养紊乱，肌肉活力丧失或减少，最后导致肠麻痹［8］。

实验中为了避免药物作用的影响，未使用任何血管活性药物，然而在这种状态下，小肠微循环损伤的改变仍然非常明显。因此，可以认为，CPB导致的小肠微循环缺血不仅仅是机体低灌注或低心排的结果，而非生理性转流过程中的血流重新分配可能是最初的致伤原因［9］。值得注意的是，这种损伤在CPB结束后的2小时没有任何缓解的征象，反而达到了高峰。这表明，CPB诱发的炎症反应可能是肠道损伤最主要的机制，CPB过程尽管已经停止，但炎症反应却仍在继续。CPB过程中血液和血细胞与体外管道人工表面接触、泵的机械损伤、缺血再灌注损伤导致白细胞活化、炎性介质释放、血浆酶、补体活化、白细胞溢出、氧自由基释放［10－11］，这些都可以直接或间接影响微循环，导致血管收缩，血液浓缩和血流淤滞，随后内皮细胞肿胀，阻塞血管，血管通透性增加，大分子渗漏。

总之，本研究利用大鼠CPB模型和活体荧光显微镜技术，直观地研究了CPB所致小肠微循环进行性损伤的现象，初步揭示了其微观病理生理机制。研究发现，在体循环状态稳定的情况下，常温CPB可以导致大鼠明显而持续的小肠微循环损伤，血流重新分配和炎性细胞浸润可能是最主要的致伤因素。

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