六味地黄方对去卵巢雌性大鼠动脉粥样硬化模型的影响

吴 艳，李 育， 张启春，郭 瑶， 卞慧敏

（南京中医药大学药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210029）

六味地黄丸出自宋代医家钱乙所著的《小儿药证直诀》一书，具有滋补肾阴之功效，目前临床应用于女性更年期月经紊乱、潮热、盗汗、心悸、失眠、以及生殖器官与性功能变化等一系列症状［1］。流行病学研究表明，绝经后女性心血管疾病发病率逐渐上升，至65～70岁女性发病率与男性相当［2］。妇女绝经后卵巢功能减退雌激素水平下降是中老年女性心血管疾病增加的主要原因［3］。中医认为卵巢功能失调与肾、肝、脾有密切关系，肾虚是其根本原因，治疗当以补肾为主。实验研究发现六味地黄方可以提高雌激素水平，防止子宫术后胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的升高，维持血脂水平［4］。为进一步研究六味地黄方对更年期动脉粥样硬化治疗作用，我们通过雌性大鼠去卵巢复制动脉粥样硬化模型，观察六味地黄方对更年期大鼠血脂、子宫指数、性腺轴相关激素、血管紧张素Ⅱ的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级大鼠，雌性，体质量(200±20)g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK(浙)2008-0033。药物购自亳州市中西药有限公司，经本校中药鉴定室鉴定为正品，符合实验要求。六味地黄丸(熟地黄8∶山萸肉4∶山药4∶泽泻3∶丹皮3∶茯苓3)依照常法煎煮，在60℃恒温条件下，浓缩成1.0 g生药/mL的浓缩液，4℃保存备用。

1.2 药物及试剂 苯甲酸雌二醇购自天津金耀氨基酸有限公司，批号1 005051；维生素D3购自北京惠康源生物科技有限公司，批号2010 072601；青霉素购自哈药集团制药总厂，批号A091 009508；TC批号20100816、TG批号201000728、LDL批号20101025、HDL批号为20100702，试剂盒均购自北京北化康泰临床试剂有限公司；LH批号20110224、FSH批号20110225、E2 批号20110225、AngⅡ批号20110301，试剂盒购自北京华英生物技术研究所。

1.3 仪器 低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂；电子天平，北京塞多利斯天平有限公司；电热恒温水浴锅，北京东霞科学仪器厂；酶标仪，SPECTRA MAX 190，AD司；放免仪器，r-911全自动放免计数仪。

1.4 大鼠去卵巢及动脉粥样硬化模型的建立 雌性大鼠以10%水合氯醛(剂量300 mg/kg)腹腔注射麻醉，除假手术组切除两侧卵巢下方的部分脂肪，其他组均切除两侧卵巢。术后3 d每日一次肌肉注射青霉素20万单位，第4天开始连续5 d阴道涂片观察动情周期，动情周期无变化证明去除卵巢彻底。参照文献［5］方法，各实验组及模型组喂食高脂饲料，高脂饲料按3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%普通饲料比例加工而成，同时每周加灌维生素D(按15万IU/kg)1次［6］。在喂食高脂饲料30 d后检测血清TC值，选择TC值在5～10 mmol/L范围内的大鼠分组。假手术组正常喂养。

1.5 分组及方法 将TC值在5～10 mmol/L范围内的大鼠分为模型组、苯甲酸雌二醇组、六味地黄组。各组在继续喂食高脂饲料的同时按上述分组给药，苯甲酸雌二醇组:1.8×10－6g/kg，肌肉注射每3 d一次；六味地黄组:灌胃给药6.75 g/kg，每天1次；正常组和模型组大鼠灌胃给予等容积的0.5%羧甲基纤维素钠，每天一次，连续喂养11周。

1.6 血清和血浆标本的采集和指标检测 实验大鼠给药11周后禁食12 h，正常饮水。用10%水合氯醛(剂量300 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈动脉取血。室温下静置，待有血清析出时移至离心机中以3000 r/min离心10 min，分离出血清。按照相关试剂盒要求，采用酶标仪检测血清中的TC、TG、LDL、HDL浓度，计算动脉粥样硬化指数(Atherosclerosis index，AI)=(TC－HDL)/HDL。同时根据试剂盒要求颈动脉取血 1 mL 注入含有 10 μL 0.3 mol/L EDTA-Na2、10 μL 0.34 mol/L 8-羟基喹啉、5 μL 0.32 mol/L二巯基喹啉抗凝剂冰冷的抗凝管中的混匀，移至离心机中以4℃，2500 r/min离心15 min，分离出血浆。血浆标本和血清标本送北京华英生物技术研究所放免检测E2、LH、FSH、AngⅡ。

1.7 子宫指数计算 大鼠颈动脉取血致死后，迅速分离子宫。在电子天平上称量子宫湿质量，计算子宫指数:子宫指数=子宫质量(mg)/大鼠体质量(g)。

1.8 主动脉HE染色 实验大鼠颈动脉取血致死后立即沿胸主动脉上段同一部位取材，置于10%甲醛溶液中固定。逐级酒精脱水，石蜡包埋，连续切片4 μm厚，HE染色观察主动脉病变情况。

2 结果

2.1 六味地黄方对模型大鼠血脂的影响 模型组大鼠TC、TG、LDL-C水平和AI指数明显升高，HDL-C水平明显降低，与假手术组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。六味地黄方可以明显降低TC、TG、LDL-C水平和AI指数，升高HDL-C水平，与模型组比较有差异或显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 对模型大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响 ()

表1 对模型大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响 ()

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2.2 六味地黄方对模型大鼠子宫指数、E2、LH、FSH、AngⅡ水平的影响 模型组大鼠血清E2水平、子宫指数明显降低，与假手术组有显著性差异(P＜0.01)。六味地黄方有升高E2水平和子宫指数的趋势，但升高幅度小于雌二醇组，且与模型组比较无显著性差异。雌二醇组大鼠的E2水平、子宫指数明显升高同时LH、FSH水平明显降低，与模型组及六味地黄组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。六味地黄方可以明显降低大鼠AngⅡ水平，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。见表2。

2.3 光学显微镜观察主动脉HE染色 见图1。

表2 对模型大鼠子宫指数、E2、LH、FSH、AngⅡ的影响()

表2 对模型大鼠子宫指数、E2、LH、FSH、AngⅡ的影响()

注:六味地黄组与雌二醇组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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图1 光学显微镜观察主动脉HE染色

假手术组:组织学切片可见主动脉壁组织学结构正常，内皮细胞完整。弹力纤维分布均匀，排列整齐，未见异常改变。中膜平滑肌细胞排列整齐、均匀、厚度正常。

模型组:动脉内膜中度增厚，纤维轻度隆起，内皮细胞肿胀、变性、部分缺失；中膜增厚伴平滑肌细胞增生、胞体变大、排列紊乱，内膜及中膜均可见巨噬细胞。

E2组:动脉内膜内皮细胞肿胀、变性、部分缺失，动脉内膜未见增厚，中膜平滑肌细胞排列较正常，见少量泡沫细胞及脂质沉积。

六味地黄组:内膜内皮细胞完整、排列整齐，内弹力膜清晰完好，动脉内膜未见增厚，中膜平滑肌细胞排列较正常，见少量泡沫细胞及脂质沉积。

3 讨论

妇女绝经后卵巢功能减退，雌激素水平降低，引起血脂变化可引起脂质代谢紊乱，成为心血管疾病发生率增加的重要因素。近年来研究认为雌激素主要通过两个作用环节影响血脂代谢。其一，雌激素降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B，同时升高高密度脂蛋白胆固醇，改善血脂成分［7］，如果雌激素不足时，肝脏内胆固醇代谢酶的合成减少，从而影响了血脂代谢。其二，卵巢分泌雌激素减少导致下丘脑对雌激素负反馈作用削弱，引起体内促性腺激素的水平升高。在促性腺激素升高的同时，促肾上腺皮质激素的分泌也升高，这样肾上腺皮质功能会有一定程度的亢进，引起体内胆固醇的升高［8］。血清中TC、TG及LDL-C水平升高和HDL-C水平下降是诱发动脉粥样硬化的重要因素，其中LDL-C是动脉硬化的易患因子，其浓度与动脉硬化的发生率呈正相关。我们研究中发现雌性大鼠去卵巢复制动脉粥样硬化模型后血脂水平比假手术组明显升高，给予六味地黄汤以后TC、TG、LDL-C、AI指数显著降低，HDL-C 显著升高，主动脉病理HE染色显示动脉粥样硬化病变减轻，表明六味地黄方可通过降低更年期动脉粥样硬化大鼠的血脂，升高HDL-C阻止更年期动脉粥样硬化的发展。

许多证据表明，女性卵巢产生的雌激素对女性心血管系统有保护作用。Amparo等发现使用雌二醇可以阻止早期动脉粥样硬化化形成［9］。在研究中我们发现模型组大鼠的血清E2水平明显下降，而LH、FSH水平有所升高。给予六味地黄方后E2水平和子宫指数均有升高的趋势，但与模型组比较无显著差异，推测六味地黄方可以部分改善雌性大鼠在切除双侧卵巢后雌激素分泌的情况。六味地黄方虽然可以升高雌激素水平，但升高的程度并不足以恢复至正常水平，说明六味地黄方可能不只是通过调节性腺轴的途径减轻更年期动脉粥样硬化的病变。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的活性过度增强是心血管疾病尤其是动脉粥样硬化形成与维持的一个重要原因，而AngⅡ是其中比较重要的成分。AngⅡ与动脉粥样硬化的关系日益受到人们重视，它直接作用于血管壁引起血管收缩，促进SMC增殖及血管重构；刺激交感神经、醛固酮等的分泌［10］。此外AngⅡ与高脂血症具有协同作用，可以促使LDL氧化修饰为ox-LDL进而促进动脉粥样硬化的发生［11］。AngⅡ还可以诱导多种炎症因子的表达，促进平滑肌细胞的增殖，参与动脉粥样硬化发生和发展过程。有研究发现AngⅡ的升高可以加速动物模型动脉粥样硬化的形成［12］。目前尚没有AngⅡ与更年期动脉粥样硬化关系的报道，但是本研究中发现六味地黄方可以显著降低去卵巢雌性大鼠AngⅡ水平，因此六味地黄方可能通过降低AngⅡ的水平阻止更年期动脉粥样硬化的发生。

综上所述，六味地黄方有改善更年期动脉粥样硬化的作用，该作用与调节血清脂质水平，降低AngⅡ的作用有关，而六味地黄方改善性腺轴激素的作用不是其治疗更年期动脉粥样硬化的主要途径。

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