美洲大蠊中甘露醇的提取工艺研究

肖培云，杨永寿，李树楠，契栖

(大理学院药学院，云南大理671000)

蜚蠊为昆虫纲蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂，全世界发现并记载的蟑螂种类3 000余种，广泛分布于热带、亚热带地区。蜚蠊作为药用最早载于《神农本草经》，目前被研究利用的主要为美洲大蠊(Periplaneta americana)，且以美洲大蠊为原料已开发出“康复新液”、“肝龙胶囊”、“心脉龙注射液”等系列新药［1］。近年来的研究发现，美洲大蠊中含有对肝炎、心血管疾病、肺癌及恶性纤维瘤有显著疗效的活性成分。经研究该成分主要为多元醇、小分子多肽和黏糖氨酸。多元醇有自由基清除作用，用于治疗病毒性心肌炎，爆震性耳聋，乙脑等［2］。甘露醇为多元醇化合物，文献报道［3］可用比色法测定其含量，此法特异性较高，许多含羟基的物质包括单糖等对其无明显干扰，本实验采用正交设计优选美洲大蠊药材中甘露醇的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器UV2500紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器公司);AL204-IC电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);DZKW-4电子恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-ⅢA循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);SB5200DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司);DHG-9420A电子恒温鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)。

1.2 试药美洲大蠊(批号20110415，由云南省大理弥渡美蠊养殖基地提供)，甘露醇标准品(中国药品生物制品检定所，批号100533-200301)，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 Nash(乙酰丙酮)试液的配制称取150 g醋酸铵，加适量蒸馏水溶解，再加入3 mL冰醋酸和2 mL乙酰丙酮，转移至1 000 mL量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。将配好的试剂储存于棕色试剂瓶中，室温放置12 h后保存于冰箱中备用(试液在最初的12 h内颜色会变暗，故应放置稳定后再用)，配好的试液可在6～8周内使用［4］。

2.1.2 0.015 mol/L高碘酸钾溶液的制备精确称取高碘酸钾3.2 g，用0.12 mol/L HCl溶解并定容至1 000 mL，混匀，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备取烘干、粉碎过2号筛的美洲大蠊药材500 g，于圆底烧瓶中，加适量石油醚，50～60℃水浴回流1 h进行脱脂处理，回收石油醚，药渣于50～60℃烘干，备用。精称脱脂后的美洲大蠊供试品10 g，置圆底烧瓶中，加蒸馏水80 mL，回流1 h，过滤，同法提取3次，合并滤液，减压浓缩，转移至100 mL量瓶中，定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.4 标准品溶液的配制精密称取干燥至恒质量的甘露醇标准品10 mg，置10 mL量瓶中，加水定容，摇匀，即得质量浓度为1 mg/mL的标准品贮备液。精密吸取甘露醇标准品贮备液4 mL于100 mL量瓶中，加水定容，摇匀，即得质量浓度为40 μg/mL的标准品工作液。

2.2 测量波长的选择分别取甘露醇标准液，供试液适量于25 mL量瓶中，加入1 mL 0.015 mol/L的高碘酸钾溶液，室温反应10 min，加入4 mL新配制的Nash试剂，50℃水浴加热15 min［4］，冷却，用蒸馏水定容至25 mL，混匀。用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，结果显示标准液和供试液在412 nm处均有最大吸收(见图1)，因此确定本实验的测量波长为412 nm［5］。归，得回归方程:Y=0.089X－0.441 7(r=0.999 1)。结果表明，甘露醇标准液在8～16 μg/mL质量浓度范围内与吸光度成良好的线性关系［5-6］。

图1 药材和对照品吸收光谱图

2.3.2 精密度试验精密吸取同一标准品溶液，按2.3.1项下方法显色并测定吸光度，连续测定6次，吸光度值的RSD为0.15%，表明精密度良好。

2.3.3 重复性试验精密称取批号为20110415脱脂后的美洲大蠊供试品6份，每份10 g，按2.1.3项进行提取，再按

2.3.1 项方法测定吸光度，计算得供试品中甘露醇平均质量分数为22.69 mg/g，RSD为1.5%，表明该方法具有良好的重现性。

2.3.4 稳定性试验精密称取批号为20110415脱脂后的美洲大蠊供试品，按2.1.3制备得供试品溶液，再按2.3.1项方法显色后每隔0.5 h测定1次，共测定7次，计算得甘露醇含量的RSD为1.95%，结果表明美洲大蠊中甘露醇的提取液在3 h内稳定。

2.4 甘露醇的提取工艺

2.4.1 提取方法的选择精密称取脱脂后的美洲大蠊供试品10 g，加60 mL水，分别采用索氏提取、回流提取、超声提取的方法各提取1 h，过滤，定容至100 mL，按2.3.1项下方法测定甘露醇的含有量，结果见表1。

表1 提取方法的考察(n=3)

2.3 方法和结果

2.3.1 标准曲线的绘制精密吸取2.1.4项的甘露醇标准品工作液5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL，分别置25 mL量瓶中，加1 mL 0.015 mol/L的高碘酸钾溶液混匀，室温放置10 min，加4 mL新配制的Nash试剂，50℃水浴加热15 min显色，冷却，于412 nm处测定吸光度值。以甘露醇标准液的质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，进行线性回

实验结果表明，索氏提取的含量最高，回流提取的其次，超声含量最低，考虑索氏提取和回流提取无显著差异，而回流提取操作简便，故采用回流提取法。

2.4.2 溶剂浓度的选择精密称取脱脂后的美洲大蠊供试品10 g，置圆底烧瓶中，按表2分别加入不同浓度的甲醇溶液60 mL，回流提取1 h，过滤，定容至100 mL，取适量显色测定，并计算甘露醇的含有量，结果见表2。

表2 提取溶剂考察(n=3)

由表2可知，80%甲醇和水的提取效率无显著差异，考虑到用甲醇提取毒性大且成本高，故本实验选用蒸馏水做提取溶剂。

2.4.3 液固比考察精密称取10 g脱脂后的美洲大蠊供试品6份，分别按表3精密加入蒸馏水，回流提取1 h，过滤，减压浓缩，转移至100 mL，定容。按照2.3.1项下测定甘露醇含有量。结果见表3。

表3 液固比考察(n=3)

结果表明，最佳液固比为1∶8，即10 g供试品加80 mL水进行提取。

2.4.4 正交试验为了系统考察甘露醇的提取工艺，根据预实验结果选择提取时间(A)、提取次数(B)、液固比(C)作为考察因素，各取3水平。因素水平见表4。

表4 因素水平

按正交设计表L9(34)安排试验，实验结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 正交试验结果

表6 方差分析结果

通过综合评价，各因素对甘露醇提取的影响顺序为B＞C＞A。即提取次数对甘露醇的影响较显著，提取时间，液固比的影响都不显著。甘露醇提取的最佳因素水平组合为A2B3C3，由于提取时间影响较小，从节约能源考虑，最佳提取工艺如下:回流1 h，提取3次，液固比1∶8。

2.4.5 验证性试验精称脱脂后的美洲大蠊供试品3份，每份10 g，按最佳提取工艺A1B3C3提取，按2.3.1项下方法测定，计算甘露醇平均质量分数为22.72 mg/g，与正交试验中含量最高的相接近，表明该提取工艺稳定、合理、可行性强。结果见表7。

表7 验证性试验

3 讨论

美洲大蠊为动物药，油脂含量较高，对甘露醇的提取干扰较大，因此实验中考察了脱脂的方法。方法一:将药材提取浓缩成浸膏，加沸水溶解，放置冰箱冷藏过夜，过滤，滤液定容至100 mL，备用。该方法过滤速度很慢，损失大，实验结果的重复性差，溶液颜色较深，对测定有干扰。方法二:用石油醚回流萃取油脂，加入适量石油醚回流1 h，过滤，回收石油醚，药渣低温干燥，备用。该方法脂肪去除完全，过滤速度快，可大大节省实验时间，实验结果的重复性好。

《中国药典》2010版二部中甘露醇的含量测定方法是容量法［7］，该法是用氧化剂滴定甘露醇中的醇羟基。样品中含有糖类及其他还原性物质对该方法有干扰，美洲大蠊中含有大量的糖类物质［8］，故该方法不适合于美洲大蠊中多元醇的测定［9］。

紫外-可见分光光度法测定甘露醇的原理是:在一定条件下，甘露醇与高碘酸钾反应生成黄色的3，5二乙酰-1，4脱氢二甲基吡啶，此化合物在412 nm处有最大吸收。

将半乳糖、葡萄糖、甘露糖等单糖制成50 μg/mL的溶液，用2.2项方法显色，扫描吸收曲线，结果各单糖在扫描波长内未见吸收，证明上述单糖对甘露醇的测定无干扰［10-12］。

该实验用到的显色剂为乙酰丙酮，见光会易分解，应贮藏于棕色瓶中。

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