长期运动对BALB/c小鼠恐惧记忆形成及海马区CD47表达的影响

施 翔，李 亚

体育运动对人类记忆功能的影响机制很复杂，也是现在的研究热点。近年研究发现，长期规律的运动能增强和保护大脑的功能；运动不仅能降低认知功能损伤、阿默海茨病和痴呆发病的风险，还能促进认知功能，包括学习和记忆这种高级脑功能形式[1]。目前通过一系列的相关动物实验研究表明：适宜运动训练能促进大鼠海马内钙调蛋白激酶Ⅱ（camkⅡ）、突触蛋白（SynapsinⅠ）和突触后致密物蛋白质95（PSD-95）的表达增强，有助于动物海马等与学习记忆密切相关的脑区神经元的增殖、存活和分化，促进突触传递的长时程增强（LTP），提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力[2-3]。CD47分子又称整合素相关蛋白（Integrin-associated protein，IAP），最初是通过人体胎盘与整合素αⅤβ3共纯化，以及从血小板与β3整合素共同免疫沉淀之后形成，广泛地表达于各种血细胞（红细胞、淋巴细胞、血小板、单核细胞和中性粒细胞）表面，以及胎盘、肝和脑组织中[4]。它是一种50KD的膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族的成员，其配体有整合素分子、信号调节蛋白（singalregulatingproteins，slRps）以及血小板凝血酶敏感蛋白（thrombospondin，TsP）[5]。CD47分子是通过与其配体相互作用而对机体发挥重要的调控作用。目前对CD47的研究主要集中在红细胞溶血疾病的治疗、对免疫调控作用的影响以及在卵巢癌治疗中的靶点作用，关于CD47在中枢神经系统的研究报道甚少[6-8]。国外神经生物学家通过虫媒病毒（Sindbis virus）作为逆转录基因载体对大鼠进行了基因载体介导实验研究，提出了CD47在大脑皮质神经元的发育早期能明显地有利于树突的生长，其在促进大脑皮质神经元发育以及中枢神经系统的整合上具有一定的积极作用[9]。

本研究旨在前人研究的基础上，验证长期中度跑步运动训练是否可以改善BALB/c小鼠学习记忆行为的表现，同时进一步分析其背后的生理生化机制是否牵涉CD47的表达，为研究运动对学习记忆促进作用的机理提供新的理论和实验依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 实验动物 本实验采用11周龄的健康雄性BALB/c品系小鼠共40只，体重20～25 g，购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物饲养在标准的塑胶鼠笼，分笼饲养，每笼5只，给予充分的饲料及饮水。动物饲养室的温度维持在23℃～26℃，湿度维持在60%，光照时间在7：00～19：00之间。

1.1.2 实验材料 大小鼠跑步机购于美国HARVARD公司；BA-200小鼠避暗仪购于上海软隆科技发展有限公司，产品型号为 BW-BTM703；分光光度计（Eppendorf Biophoto，USA）；肾上腺皮质酮检测试剂盒（酶联免疫法）购于英国IDS公司，货号AC-14F1；考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物公司；组织蛋白裂解液购于碧云天RIPA裂解液，产品编号为P0013B；凝胶成像系统（Kodak Image Station 4000R，USA）。

1.2 方 法

1.2.1 实验方案 本研究利用跑步机使11周龄小鼠接受2、3、4周的长期中度运动训练。运动训练都在白天进行。当小鼠11周大时，先进行熟悉适应训练，跑步机转速为9 m/min，每天10 min。5天之后把动物随机分成运动训练组和对照组，2组按如下方案进行分配。

（1）运动训练组小鼠20只，在适应训练后接受2、3、4周的运动训练，实验组的运动训练强度参照谢康玲文章[10]的小鼠运动训练中的中强度运动训练方式进行设置。运动训练开始的第1周，跑步机的转速设定为9 m/min，跑步20 min，每天逐渐递增10 min，直到60 min为止；第2周开始转速设定为9 m/min，每天运动60 min；第3～4周转速设定为10 m/min，每天运动60 min。急性运动试验，运动组将接受单次急性运动，跑步机的转速为9 m/min，时长为60 min。

（2）对照组小鼠20只，在适应训练后放在跑步机上10 min但不运动；在急性运动试验中，同样采取放在跑步机上10 min但不运动的方案。

（3）以上实验方案进行2次重复，第1次重复，在小鼠训练运动结束后0 h和24 h 2个时间后对小鼠进行组织取样，测定肾上腺皮质酮浓度等相关指标；第2次重复，通过小鼠避暗实验观察BALB/c小鼠恐惧记忆形成表现。

1.2.2 组织取样 上述各组小鼠根据实验方案，在预定的时间内用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉后，眼眶取血处死小鼠后快速断头取脑。在预冷的0.01PBS取出双侧海马组织和小腿比目鱼肌，置于液氮速冻后，放置-80℃冰箱进行保存。血液在冰上静置30 min后，在4℃下2 000 g离心30 min，收集上清放置-80℃冰箱进行保存。

1.3 相关指标的测定

1.3.1 柠檬酸合酶活性的测定 将肌肉放置室温5 min后加入裂解液（0.1M Tris buffer+0.1%Triton X-100）匀浆，在4℃下15 000 rmp离心15 min后，取上清到离心管，调整蛋白质的浓度到1.5μg/μL，参照SRERE的方法测定柠檬酸合酶活性[11]。配置测定溶液（含有 0.1 mol/L Tris-HCl（Ph8.1），0.1 mmol/L 5-5'-二硝基苯，0.3 mmol/L乙酰辅酶A，0.5 mmol/L/草酰乙酸）。具体方法如下：将测定溶液990μL置于分光光度计中30℃预热 3 min后加入10μL样本（蛋白质含量为1.5μg/μL），总体积为1 mL混匀后，5 s记录412 nm处吸光度增加的速率。计算公式如下：样本酶活性（IU）=（△A/min×T.V×106）/（ζ×1×S.V），其中△A/min为每分钟吸光度的变化；TV为反应系统总体积；SV为样本体积；ζ为被测物（产物或底物）的摩尔吸光系数；ζ=16.595×103 mol/L，活力以nmol/min/mg蛋白表示。

1.3.2 肾上腺皮质酮浓度的测定 该试剂盒应用竞争性酶联免疫分析法，采用抗肾上腺皮质酮多克隆抗体包被于聚苯乙烯微孔板内表层。标准品、质控品和稀释样品与肾上腺皮质酮标记酶在微孔中一同孵育过夜（2℃～8℃），洗涤微孔后加入TMB，在405 nm波长处测量所有孔的吸光度。所有操作根据试剂盒说明书进行。大小鼠血清样本中肾上腺皮质酮的浓度参考范围：23～363 ng/mL。

1.3.3 避暗实验 实验前将避暗潜伏期大于180 s的小鼠弃去不用。避暗仪暗室底部铜栅通36 v、50 Hz交流电，先将小鼠放入避暗仪反应箱中训练3 min，小鼠受电击逃往明室。正式测试开始时，将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室则受到电击，避暗仪自动记录小鼠5 min内首次进入暗室的时间，即为避暗潜伏期。第1天上午9：00开始训练实验，次日上午9：00（训练实验24 h后）进行测试，记录5 min内小鼠避暗潜伏期，即为BALB/c小鼠恐惧记忆形成的模型[12]。

1.3.4 CD47蛋白质表达量的测定 称取一定量的海马组织，加入碧云天RIPA裂解液，在冰上匀浆，4℃12 000 g离心15 min后取上清，利用考马斯亮蓝试剂盒测定所提取总蛋白的浓度。将不同组别的小鼠海马组织匀浆液上清定成相同的量后，加入1×上样缓冲液在沸水中煮沸5 min。平衡各上样孔的蛋白量后，按照每孔30μg，配置12%分离胶和5%的积层胶。积层胶采用70 mV电流电泳60 min；分离胶段采用100 mV电泳约120 min或待溴酚蓝跑至分离胶底部上1 cm时终止电泳。将积层胶切去后，用湿转法检测总蛋白中CD47和β－actin的表达量。PVDF膜转膜前用甲醇浸泡30 s，然后用转移液浸泡5 min，采用200 mA电流转膜90 min。转膜完成后，用5%脱脂奶粉的封闭液4℃封闭过夜，室温下封在封闭液中孵育CD47、β－actin蛋白一抗和羊抗小鼠IgG二抗各1 h。用TBST洗膜后通过ECL法进行显色，在凝胶成像系统下观察，Quantity One v4．6．2软件对结果进行分析和比较。

1.4 数据处理

采用SPSS15．0统计软件进行分析，所有的定量数据均先进行正态性检验，符合正态分布的资料采用均数±标准差（±sD）来表示。2组资料的比较采用独立样本T检验、皮质酮和避暗实验在组内和不同组间的比较采用配对T检验和独立样本t检验。在不同组和不同时间点CD47变化用蛋白浓度灰度比值进行分析，采用两因素析因设计资料的方差分析，其中P＜0．05。

2 实验结果

2.1 长期中度跑步机运动后柠檬酸合成酶活性的变化

图1 长期中度跑步机运动后柠檬酸合成酶活性的变化

在经过4周中度运动训练之后，运动组的柠檬酸合成酶活性（0．201±0．018）大于对照组（0．170±0．017），且差异显著（t=3．50，P=0．004）（见图 1）。Figure 1 detecting the citrate synthase（CS）after long-term and moderate treadmill exercise training

2.2 长期中度跑步机运动后不同时间点肾上腺皮质酮的浓度

表1结果显示：4周最后一次运动后0 h，运动组肾上腺皮质酮浓度为 86．69±18．07 ng/ml，大于对照组（44．17±7．29 ng/ml），且差异显著（P＜0．05）；实验后24 h，运动组的肾上腺皮质酮浓度与0 h时相比，有显著降低（P＜0．05），此时的浓度为 47．57±10．43 ng/ml，与对照组的（45．04±7．02 ng/ml）差异不显著（P＞0．05）。

表1 长期中度跑步机运动后不同时间点的肾上腺皮质酮浓度（ng/mL）Table 1 concentration of corticosterone at different time after long-term and moderate treadmill exercise training（ng/mL）

2.3 长期中度跑步机运动后小鼠恐惧学习能力的行为表现

表2结果显示：经过4周中度运动训练，运动组和对照组在PA测试中,训练期平均通过活门到达暗区的时间分别为11．1±3．6 s和 10．5±4．2 s，差异不显著（P＞0．05）。在经过 24 h 后开始的测试期中，之前暗区与被电击所连结的恐惧记忆会反应在亮区滞留的时间上，且待在亮区的滞留时间越长意味学习记忆能力越改善。结果显示：对照组和运动组在测试中，测试期平均通过活门到达暗区的时间分别为 130．6±42．4 s 和 338．0±70．6 s，差异显著（P＜0．05），运动组比对照组在小鼠恐惧学习能力上提高了1．72倍。

表2 长期中度跑步机运动后小鼠恐惧学习能力的行为表现Table 2 The learning and memory behavioralperformance of BALB/c mice after long-term and moderate treadmillexercise training

2.4 运动训练后不同时间点海马回中CD47蛋白质表现的变化

结果显示：在最后一次运动后的0 h，在2、3和4周3个时间点运动组海马回中CD47蛋白质均较对照组表现上升，差异显著（P＜0．05）。而在最后一次运动后的24 h，在第2周时，运动组海马回中CD47蛋白质已回落到对照组水平，与同期对照组比较差别不显著（P＞0．05）；在第 3 周时，CD47蛋白质虽有下降，与0 h比差别显著（P＜0．05），但仍高于同期对照组水平，差别显著（P＞0．05）；在第4周时，CD47蛋白质虽略有下降，但与0 h比差别不显著（P＞0．05），显著高于同期对照组水平，差别显著（P＞0．05）（见图2）。

图2 运动训练后不同时间点海马回中CD47蛋白质表现的变化Figure2 expression of CD47 in hippocampiafter the different time of exercise training

2.5 单次急性中度运动后海马回中CD47蛋白质表现的变化

为了探讨2周中度运动训练后，所造成的大脑海马回中CD47蛋白质表现的增加，是否为急性运动的效果，而非运动训练的效果。本研究利用单次与运动训练同样的运动强度、时间长度测量海马回中CD47蛋白质的表现。结果显示：经过急性运动后，运动组与对照组海马回中CD47蛋白质的表现没有差异（P＞0．05），这表明单次急性运动不会造成海马回中CD47蛋白质的表现上升（见图3）。

图3 单次急性中度运动后海马回中CD47蛋白质表现的变化Figure 3 expression of CD47 in hippocampiin once acute exercise

3 分析与讨论

3.1 长期中度跑步运动对小鼠学习记忆行为的影响

临床研究和实验室研究都证明了长期规律的运动能增强大脑的学习和记忆功能[13]。以往研究中，运动对学习记忆能力的影响主要机制在于脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）作用于海马结构内丰富表达的N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）及 α-氨基-3-羟-5-甲基-4-异恶唑丙酸（a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolep-propionate receptor，AMPAR）而引起信号通路激活[14]，从而引起大脑学习和记忆功能的增强，本研究丰富了这一学说。在本实验中，长期跑步机运动训练可以提高BALB/c小鼠比目鱼肌中柠檬酸合酶活性，证明本实验的小鼠运动模型是成功的，通过长期跑步机运动训练能够达到强化小鼠比目鱼肌的训练效果。进一步，在经过4周长期跑步机运动训练后，通过避暗实验评价运动对小鼠记忆和学习能力的影响，主要表现在小鼠在亮区滞留的时间长短。结果表明：测试期运动组小鼠比对照组在恐惧学习能力上提高了1.72倍，即它在亮区滞留的时间越长。成功验证了长期中度跑步运动的确能够改善小鼠学习记忆行为的表现，这点也与其他研究结果类似[15]。

3.2 运动时间对BALB/c小鼠海马回中CD47蛋白质表达的影响

CD47最初是发现在人类胎盘和骨髓里的造血母细胞中[16]，在神经系统中，CD47的功能主要是负责在发育以及神经生长期间帮助细胞骨架重组[17]。CD47被视为一种细胞黏着的分子，提供了在细胞与细胞之间或是细胞与胞外间单独执行功能的受体可能性；CD47也是TSP（血小板反应蛋白 Thrombospondin）的受体，已经确定CD47在血管内皮细胞的迁移、增殖、存活的调节中发挥重要的作用。而某些TSP-1能够促进突触的形成、激发神经纤维的生长。有文献指出，大鼠海马区CD47基因的高表达与小鼠记忆形成有关系，然而这些研究仅仅停留在mRNA水平，通过对小鼠海马区与记忆形成相关区域的研究，发现在这些区域中，细胞中CD47的信使RNA（Messenger RNA，Mrna）都是呈高水平表达的形式，CD47缺乏的小鼠的学习与记忆能力较正常小鼠相比，相差甚远[18]，但是，并没有从蛋白水平给予最直接的证据[19]。也有实验证实CD47-SIRPa（抑制性受体信号调节蛋白a）信号通路有利于神经元细胞及其周边分支的形成，并对神经元的棘突与伪足的形成有着至关重要的作用，有利于生物记忆[20]。本实验中，我们测得了第2、3、4周运动后0 h和24 h CD47蛋白表达的水平，结果发现对照组，即没有接受任何训练的小鼠海马区CD47的表达较为稳定，维持在正常范围内；而接受训练后的小鼠CD47呈现高表达，说明运动的确可以诱导小鼠海马区CD47的高表达。这种CD47的高表达是否能持续24 h呢，还是与运动累积的时间相关呢？在给予2周运动量的时间后，最后一次运动后24 h的CD47表达基本回落到对照组水平；在第3周，CD47的表达水平高于对照组却低于结束训练时CD47的水平；而到第4周，CD47的高表达可以维持到24 h。说明这种CD47表达的时间持续性与运动时间累积的长短性具有显著的相关性，而不是与运动量的累积相关。有文献报道，跑步机运动训练对记忆的改善具有时间依赖性[21]，由此，我们可以推测小鼠运动时间越长，CD47表达越稳定，小鼠学习记忆行为能力可能越强。

3.3 BALB/c小鼠海马回中CD47蛋白质表达的调控机制

在本研究中，4周长期跑步机运动训练后，小鼠血清中肾上腺皮质酮水平升高。由于肾上腺皮质酮参与机体对一切有害刺激的应激反应，小鼠运动后外源性刺激能够诱导肾上腺皮质酮水平升高符合实际情况。同时它对脑及脑垂体都具有反馈作用，从而可调整促肾上腺皮质素释放因子和促肾上腺皮质素的分泌。本试验中，实验结果发现运动后的24 h，运动组的肾上腺皮质酮浓度已恢复到正常水平，说明负反馈调节成功。有研究表明，运动对下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）分泌有影响作用，同样是通过应激所产生的肾上腺糖皮质激素作用与海马中的糖皮质激素受体而影响学习和记忆形成[22-23]。然而HPA轴分泌与CD47表达之间的关系并不清楚。

NRF-1为调控CD47的转录因子之一[24]，同时NRF-1也是其他与记忆学习相关分子的转录因子[25]，借由这条路径亦可对CD47激活的信号通路做进一步解析。此外，丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase MAPK）的活化也需要CD47-介导神经元的影响，MAPK信号通路是生物体内重要的信号传导通路之一，MAPK信号通路通过此激酶的顺次磷酸化，实现了细胞的外刺激信号向细胞核的转移，在海马依赖的学习、记忆功能以及长时间增强（LTP）和海马结构的重塑中发挥了重要的作用。

4 结 论

综上所述，海马区的CD47能改善小鼠的记忆能力，这将有助于解释运动能帮助机体获得与保持记忆的原因，也为运动对记忆损伤以及老年痴呆等医疗康复研究提供了一定的理论依据。同时，长期的体育运动能促使动物海马区CD47稳定表达的上升，且具有一定的运动时间依赖性，所以，人们在进行体育运动的同时，应尽量安排合理的运动时间。

关于体育运动对大脑记忆能力的影响机制是非常复杂的，大脑记忆机制存在着许多未解之谜。本文涉及的长期运动对海马区CD47的变化只是这个研究领域中的一小部分，希望不断有新的研究能为解释不同时间、不同强度以及不同种类的体育运动与神经系统功能、学习记忆改善之间的关系提供更多的实验依据，我们也将进行更深入的探讨。

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