MMP-9及VEGF蛋白在胶质瘤中的表达及其临床意义

王全懂 张蕾 杨聪颖

胶质细胞瘤约占颅内原发恶性肿瘤的40% ～50%，其不可控制的生长、较强的侵袭转移能力等生物学特性致使肿瘤易复发，预后差。细胞外基质完整与否以及肿瘤组织的血管发生是肿瘤细胞侵袭、转移的关键因素。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9 MMP-9)在细胞外基质降解中发挥重要作用，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)在诱导血管发生中起关键作用。多项证据显示二者在多种肿瘤细胞表达并与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。本研究采用免疫组织化学的法观察MMP-9及VEGF在胶质瘤中的表达，并探讨其临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 标本选自我院病理科63例胶质瘤存档蜡块。术前未接受放疗、化疗。其中，星形细胞瘤46例，胶质母细胞瘤13例，少突胶质细胞瘤3例，混合细胞瘤1例，男性33例，女性30例;年龄5～70岁，平均年龄43.3岁。术后病理分级:Ⅰ级10例，Ⅰ～Ⅱ级7例，Ⅱ级13例，Ⅱ～Ⅲ级9例，Ⅲ级8例，Ⅲ～Ⅳ级2例，Ⅳ级14例。所有的病例术前均未进行放疗和化疗。为统计学方便，把Ⅰ级、Ⅰ～Ⅱ级、Ⅱ级归类为高分化胶质瘤，Ⅱ～Ⅲ级、Ⅲ级、Ⅳ级归类为低分化胶质瘤。

1.2 试剂与实验方法 标本经福尔马林固定、石蜡包埋后，组织作5 μm连续切片，行免疫组织化学ABC法染色。兔抗人MMP-9及VEGF蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，二抗、三抗购自北京中山生物技术有限公司，染色过程如下:将瘤组织石蜡切片脱蜡入水，0.3%的甲醇-双氧水中10 min;分别将瘤组织切片浸入兔抗人MMP及VEGF抗体(1∶500 Santa Cruze)溶液中封闭;随后依次进入生物素化IgG工作液(北京中山)和SABC三抗工作液(北京中山)，室温下各孵育2 h;辣根过氧化物酶标记的DAB将免疫产物显为棕黄色;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在孵育过程中用PBS溶液代替一抗做空白对照。

1.3 染色结果判断 用光学显微镜观察并确定MMP-9及VEGF免疫阳性产物分布部位。每份标本随机取三张切片，每张切片随机取三个高倍视野，计数每张切片MMP-9及VEGF阳性细胞数目并观察染色强度，以肿瘤细胞胞浆、细胞间质及血管内皮细胞出现棕黄色颗粒为MMP-9、VEGF表达阳性。A:阳性细胞数＜10%为记阴性(-)，不论其染色深浅;阳性细胞数11% ～50%为2分;阳性细胞数为50% ～80%为3分;阳性细胞数80%以上为4分。B:染色强度呈弱染色(浅黄色)为1分，中等染色(棕黄色)为2分，强染色(黄褐色)为3分。A+B为总分，总分为3分者为弱阳性，4～5分者为中等阳性，6～7分者为强阳性。为统计学处理方便并将(-)、(+)归为阴性处理，(++)、(+++)归为阳性处理。

1.4 统计学方法 运用SPSS 11.5对数据进行χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-9在胶质瘤组织中的表达 MMP-9阳性表达48例，总的阳性率48/63=76.19%，胞浆及细胞外基质均可见MMP-9蛋白的阳性表达。其中高分化(恶性程度低)MMP-9表达呈弱阳性，阳性产物主要分布细胞间质内，阳性率为19/30例(占63.33%);低分化(恶性程度高)者33例，MMP-9表达呈强阳性，阳性产物在密集分布胞浆及细胞间质内。阳性率29/33例(占87.87%)，两者差别具有统计学意义(P=0.037)。(见图1，表1)

表1 MMP-9在低分化组与高分化组表达阳性率的比较(例，%)

图1 MMP-9在胶质瘤组织中的表达400

2.2 VEGF在胶质瘤组织中的表达 VEGF阳性表达47例，总的阳性率47/63=74.76%，VEGF蛋白的阳性主要分布与胶质瘤血管内皮细胞。其中高分化(恶性程度低)VEGF表达呈弱阳性，阳性率为17/30例(占56.67%)，低分化(恶性程度高)者33例，VEGF表达呈强阳性，阳性率，30(占90.90%)，两者差别具有统计学意义(P=0.003)。(见图2，表2)

表2 VEGF在低分化组与高分化组表达阳性率的比较(例，%)

图2 VEGF在胶质瘤组织中的表达400×

2.3 MMP-9与VEGF表达的相关性 63例中MMP-9与VEGF均阳性表达41例，MMP-9阳性的肿瘤组织VEGF也趋于阳性表达，相关性分析r's=0.3136 P＜0.05，提示MMP-9与VEGF表达呈正相关。

3 讨论

胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，研究显示尽管手术结合放化疗等相关治疗手段的不断提高，其中位生存期不超过12个月，侵袭性生长、易复发、预后差为其主要临床特征。近年来的研究显示细胞外基质降解及肿瘤血管发生是肿瘤侵袭转移的关键环节。

基质金属蛋白是一类Zn+依赖性内肽酶，具有降解各种细胞外基质的作用，其中MMP-9又称凝胶酶B，是基质金属蛋白酶MMPs家族成员之一，其在胚胎发育，细胞增殖及组织重塑等正常的生理过程中发挥重要作用。由于其高效降解Ⅳ、Ⅴ胶原纤维，故可通过破坏肿瘤组织周围的物理屏障促进肿瘤细胞的侵润及转移［1，2］。多项研究显示MMP-9在结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌及口腔癌等多种恶性实体瘤内呈高表达，并证实与肿瘤的转移相关［3-7］。本研究显示在不同级别胶质瘤中MMP-9表达强度不同，在高分化胶质瘤(恶性程度低)MMP-9表达呈弱阳性，主要分布于胞浆内及细胞间质;低分化(恶性程度高)的瘤组织中MMP-9表达呈强阳性，阳性产物在瘤体内密集分布，染色浓重;且MMP-9在低分化瘤体中阳性表达率显著高于高分化瘤体。同样Rao JS和Rooprai HK的研究显示MMP-9表达与神经胶质细胞瘤组织学分级密切相关［8，9］，这与本研究结果具有一致性，提示MMP-9表达与肿瘤组织的恶性表型相关。另有研究显示MMP-9 mRNA表达水平与胶质瘤进展呈正相关，且在脑胶质瘤的侵润、转移及血管再生方面发挥重要作用，干扰MMP-9表达可降低胶质瘤细胞的侵袭、肿瘤生长、和血管生成［10，11］。细胞试验显示抑制MMP-9表达可抑制肿瘤细胞的连接与生长［12，13］，其机制可能通过(ERK):PKCα/NF-κB 信号通路完成［14，15］。上述多项研究结果提示MMP-9可能成为预测胶质瘤恶性程及侵袭转移的生物学探针。

肿瘤的浸润生长及转移有赖于肿瘤组织血管的形成，肿瘤组织血管生成受多因素调控，有多种细胞因子及信号通路的参与，如碱性成纤维细胞生长因子，血小板源性生长因子，转化生长因子等，其中VEGF在血管发生过程中起关键作用，其机制可能通过分子变构及酶加工形成多种亚型，与细胞外基质中的乙酰肝素及细胞表面蛋白结合，释放血管源性因子，精确调控内皮细胞生长及血管生成，并且可增加血管的通透性，从而为血管内皮细胞和肿瘤细胞的转移提供结构基础。目前抗VEGF及其受体已成为肿瘤治疗的新的靶点和新策略。本研究显示VEGF在胶质瘤中的阳性表达主要位于血管内皮细胞，少量位于细胞间质，在不同级别胶质瘤中有不同程度的表达，随着胶质瘤的级别愈高其表达强度愈高，差异具有显著性，同时在低级别胶质瘤中阳性表达率与高级别阳性表达率相比差异具有统计学意义，提示其表达阳性率及表达强度与胶质瘤恶性程度密切相关。

在本研究中MMP-9阳性表达主要弥散存在于胶质瘤细胞的胞浆、细胞间质内;VEGF蛋白表达于血管的内皮细胞，未见到明显的边缘效应，MMP-9及VEGF蛋白在脑胶质瘤中表达上调，并且脑胶质瘤分级越高，分化越差，MMP-9及VEGF蛋白表达越强，提示MMP-9及VEGF蛋白表达与脑胶质瘤的恶性程度相关。提示联合检测MMP-9及VEGF蛋白可作为判断胶质细胞瘤侵袭转移能力的客观指标，对胶质瘤的预后判断具有一定意义。

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