引起犬子宫蓄脓细菌的分离鉴定

徐文必 （云南省宣威市格宜镇畜牧兽医站 655404） 沈学文 （云南省红河州动物疫病预防控制中心 蒙自） 肖啸* （云南农业大学动物科学技术学院 昆明）



引起犬子宫蓄脓细菌的分离鉴定

徐文必 （云南省宣威市格宜镇畜牧兽医站 655404） 沈学文 （云南省红河州动物疫病预防控制中心 蒙自） 肖啸* （云南农业大学动物科学技术学院 昆明）

本试验采集了患子宫蓄脓病犬子宫的内容物，并对所有细菌进行血分离和纯化培养，部分细菌做麦康凯、伊红美蓝、和CAMP试验，然后对纯化的菌株做必要的生化鉴定，共分离到36个菌株，其中有24株大肠杆菌，9株金黄色葡萄球菌和3株疑似疑似棒状杆菌菌等。药敏试验表明，大肠杆菌的敏感药物为恩诺沙星等，金黄色葡萄球菌的敏感药物为头孢孟多、诺氟沙星等。

子宫蓄脓 分离鉴定 药敏试验

近年来，犬作为伴侣动物和宠物，养殖数量逐渐增加，犬的产科疾病，尤其是子宫蓄脓症越来越多见。子宫蓄脓症是犬发情后期的一种急性或慢性疾病，多发于成年犬，往往涉及多个系统[1]。根据临床症状可将子宫蓄脓分为开放型子宫蓄脓和闭锁型子宫蓄脓，后者若不进行迅速有效的药物治疗可发生脓毒血症或致死亡[2]。本病一年四季均可发生，无明显的季节性。

子宫蓄脓是由于继发或原发性原因，子宫分泌增加、储纳恶露而导致子宫丧失正常生理功能，且严重危害患病动物健康的疾病。细菌感染是子宫蓄脓的重要原因。抗菌药物是预防和治疗细菌性传染病的主要措施，但是细菌对抗菌药物的耐药性程度和频率越来越高，开发新的抗生素难度大，耗资高，周期长，投入使用不久后又可能产生抗药性[8]。解决这一问题的关键是在临床诊疗过程中，利用实验室进行细菌分离、鉴定，以确定致病菌，然后通过药敏试验对抗菌药物的临床治疗效果进行预测，筛选出敏感药物，进行针对性治疗，以提高疗效和节省治疗费用。试验中的病例为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和疑似链球菌混合感染，且各分离菌已对某些抗菌药物产生不同程度的耐药性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器设备 冰箱、立式圆形压力蒸汽高皿压灭菌器、高压消毒器、干燥箱、培养、 PGX型多段可编程光照培养箱、SW-CJ-1FD型单人单面超净工作台、镊子、接种环、酒精灯、锥形瓶（100ml，1000ml），载玻片、染色缸、染色架、涂抹棒等。

1.1.2 主要材料与试剂 子宫蓄脓犬的子宫脓液(子宫内容物)6份，普通琼脂、营养琼脂、营养肉汤、血液琼脂、麦康凯琼脂、三铁糖培养基及按实验室常规方法自制的大肠杆菌生化鉴定试剂、金黄色葡萄球菌生化鉴定试剂及生化培养基。

1.1.3 药敏纸片 庆大霉素、恩诺沙星、林可霉素、头孢吡肟、菌必治、妥布霉素、链霉素、诺氟沙星(氟哌酸)、氨苄西林、四环素、氯霉素、头孢拉定、红霉素和头孢孟多，均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病料采集及保存 （1）子宫蓄脓犬的确定。从2011年3~5月农大动物医院就诊犬中，选择临床症状出现腹围增大、阴户肿胀或阴门流脓，经B超腹部探查，子宫内出现液性暗区的犬6头，确定为子宫蓄脓犬。（2）病料的采集。选择临床症状符合子宫蓄脓的病例，对其进行卵巢子宫切除术获得子宫及其内容物或直接用灭菌棉签通过阴道从子宫采集其内容物，放入灭菌试管中送检。不能及时送检的，暂时保存于冰箱之后送检。

1.2.2 细菌培养、生化鉴定和药敏试验 （1）分离培养。在超净工作台中将采集的子宫内容物用划线法接种于营养琼脂、普通琼脂、血琼脂等培养基上，置于37℃恒温培养箱培养24~48h，观察细菌的生长情况。如为混合菌落，则挑取不同菌落接种于培养基进行纯培养。获得单一茵落后，革兰氏染色镜检，并根据细菌特征做鉴别培养、生化鉴定试验和药敏试验。（2）鉴别培养。麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基培养法：该方法是为了鉴别肠杆菌科细菌。大肠杆菌在麦康凯琼脂培养基上呈粉红色菌落为阳性，伊红美蓝琼脂培养基上呈铁锈色菌落为阳性，不生长为阴性。CAMP实验：在血平板上，先接种1条金黄色葡萄球菌的划线，与此垂直接种被检细菌，培养24h后出现明显的β溶血现象证实为金黄色葡萄球菌球菌[9]。（3）细菌鉴定。染色镜检：试验采用的是细菌学广泛使用的鉴别染色法-革兰氏染色。首先将细菌在干燥的载玻片上涂匀并固定好，滴加草酸铵结晶紫作用2min后水洗，然后滴加革兰氏碘液媒染2min后水洗，再以95%酒精脱色1min水洗，继而滴加石碳酸复红复染30s后水洗，最后等涂片干燥后拿于显微镜下观察，染色效果好的片子取照。革兰氏染色颜色是蓝紫色的为阳性菌，红色的为阴性菌。生化鉴定：参照《兽医微生物学实验指导》第二版的方法进行细菌的生化鉴定[10]。把用于镜检的另一半菌落接种于三糖铁培养基中，在37℃恒温培养箱培养24h后，观察变化。从三糖铁培养基中挑菌落到营养琼脂和血琼脂上进行纯培养，用于进行生化试验及存种。左起：精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山犁醇。

图1 生化试验接种前

试管架另一侧的生化管左起：葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验

图2 生化试验接种前

总之，细菌为革兰氏阴性杆菌，营养琼脂上呈现乳白色、圆形、隆起的中等大小菌落，血琼脂上菌落灰白色、圆形隆起、湿润、不溶血，则转接种于麦康凯培养基，37℃培养24h后，如长出粉红色中等大小菌落，则挑取菌落按常规法做氧化酶及葡萄糖发酵试验，如为氧化酶阴性，发酵葡萄糖，则按肠杆菌科细菌接种于肠杆菌科细菌生化鉴定试剂盒，37℃培养24h。根据反应结果，查表确定细菌类型；如为革兰氏阴性杆菌，氧化酶试验阳性，葡萄糖发酵试验阴性，则接种于非发酵革兰氏阴性杆菌生化鉴定试剂盒，37℃培养24h。根据反应结果，查表确定细菌类型；如镜检为革兰氏阳性球菌，按常规方法做触酶试验。触酶试验阳性者，加做葡萄糖发酵试验，如为阳性，则按葡萄球菌属接种于葡萄球菌属细菌生化鉴定试剂盒。根据反应结果，查表确定细菌类型；如镜检为革兰氏阳性球菌，触酶试验阴性，按链球菌鉴定方法做进一步做甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、七叶营、山梨醇、蕈糖、血清菊糖发酵试验，精氨酸、马尿酸盐、明胶水解试验，胆汁溶菌试验。根据反应结果，确定细菌类型。

1.2.3 药敏试验 （1）纸片的选用。按照纸片扩散法对所有分离株进行抗茵药物的敏感性试验。药物纸片包括氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、头孢唑啉、头孢拉定、头孢曲松、头孢哌酮、痢特灵、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、四环素、氯霉素、强力霉素、阿奇霉素、青霉素、红霉素和氧氟沙星，共19种。不同种属根据《抗菌药物敏感性试验的执行标准》推荐抗菌药物，并结合临床抗菌药物使用情况，选取不同的药敏纸片集。（2）操作方法。药物敏感试验按常规纸片法进行，将分离出的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤，37℃培养24~36h，取纯培养菌株用灭菌自制“L”形玻璃棒均匀涂布于普通营养琼脂平板，用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，每个平板贴7张纸片，各片距离要相等，贴完后放入4℃冰箱感作1h，再将平板倒置于恒温培养箱。37℃培养24~48h后，量取抑菌环直径并做记录（每种药做2个平行试验，取平均值作为报告值）。

2 结果与分析

2.1 细菌培养鉴定

6份子宫内容物的细菌培养中，1份没有培养出细菌，约总数的16%，5份阳性，阳性率约为83%，其中单纯感染1份，占阳性数的20%(1/5)，混合感染5份，占阳性数的80%(4/5)，共培养出细菌36株，分别为大肠埃希菌24株，占1/3，金黄色葡萄球菌9株，占1/4，疑似链球菌3株，占1/12。

2.1.1 培养结果 见图3、4。

图3 疑似大肠杆菌

图4 疑似金黄色葡萄球菌

2.1.2 镜检结果 见图5、6、7。

图5 疑似大肠杆菌

图6 疑似金黄色葡萄球菌

图7 疑似棒状杆菌

2.1.3 鉴别试验结果 （1）CAMP试验结果。在细菌分离培养过程中，其中有9株菌株菌落颜色呈金黄色最为明显，所以拿来做CAMP实验[11]。（2）大肠杆菌在麦康凯培养基和伊红美蓝琼脂培养基。见图9、10。

图9 麦康凯培养基

图10 伊红美蓝琼脂培养基

2.2 生化鉴定结果

见表1。与判断标准比较后，试验所选菌株与标准判断标准相符，因此判断所选菌为大肠杆菌。

表1 生化鉴定结果

注：“+”产酸；“—”阴性；“⊕”产酸产气。+阳性，-阴性。

2.3 药敏试验结果

试验中犬子宫蓄脓症病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和疑似链球菌混合感染。这3种病原菌对几种抗菌药物的抑菌圈直径，据《现代诊断学手册》抑菌圈直径d>15mm为高度敏感；15mm>d>10mm为中度敏感；d<10mm为抗性，的判定标准，判断待测菌株对药物的敏感程度，结果见表2、3。（1）大肠杆菌的药敏试验结果显示，对大肠杆菌分离株高度敏感的抗菌药物依次为恩诺沙星；中度敏感药物为庆大霉素、头孢吡肟，而链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素耐药。结果表明只有恩诺沙星、庆大霉素、头孢吡肟对以上病例的病原菌有抑菌作用，且抑菌圈不是较大，说明大多数病原菌对以上几种药不敏感，链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素的效果相对不佳，只对其中少数病例有抑菌作用，说明很多细菌对抗生素类药物已经不敏感。（3）对金黄色葡萄球菌分离株高度敏感的药物依次为头孢孟多、诺氟沙星；中度敏感药物为庆大霉素，而对林可霉素、红霉素、氯霉素、四环素耐药。

表2 大肠杆菌药敏试验结果 (mm)

注：抑菌圈；S：敏感；M：中度敏感；R：抗性

表3 金黄色葡萄球菌药敏试验结果 (mm)

4 讨论

4.1 与前人研究结果相同或相似部分

引起犬子宫蓄脓最常见的病原菌是大肠杆菌，试验分离到大肠杆菌24株，占分离菌总数的2/3，与报道一致。张志强等［12］从48个病样中分离出了大肠杆菌(56.25% )和金黄色葡萄球菌(16.67% )；杨白亮等［13］从25个病样中同样也分离出了大肠杆菌(58.6% )和金黄色葡萄球菌(17.2%)；董龙等［14］从46个病样中分离到了大肠杆菌(60.87% )。这次试验中，6个病样主要分离到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，与国内外报道的主要病原结果一致。

4.2 与前人研究结果不同部分

试验于昆明两处地方采回6份犬子宫蓄脓脓样做了细菌的分离鉴定，其中云南农业大学宠物医院采回的子宫脓样，由于注射了抗生素只是鉴定出大肠杆菌。西山区康大妈流浪狗收留所采回的子宫脓样鉴定出来的既有金黄色葡萄球菌又有大肠杆菌，以大肠杆菌为主。由此推测该抗生素对球菌非常有效，而对大肠杆菌欠佳，这为今后犬子宫蓄脓的预防和治疗提供了科学的依据。

药敏试验结果表明，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对各种抗生素的敏感性不尽相同，与各研究学者的报道相差很大。只有恩诺沙星、庆大霉素、头孢吡肟对以上病例的大肠杆菌有抑菌作用，且抑菌圈不是较大，说明大多数病原菌对以上几种药不敏感。链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素的效果相对不佳，只对其中少数病例有抑菌作用，说明很多细菌对抗生素类药物已经不敏感，对临床上常用药基本耐受，这可能与宠物主滥用抗菌素有关。对金黄色葡萄球菌分离株高度敏感的药物有2种，占2/7；中度敏感药物只有庆大霉素，而对4种药物耐药，占4/7。这表明引起犬子宫蓄脓的细菌药物敏感性表现两极分化。因各菌对药物的敏感性变异比较大，所以临床医生在治疗犬子宫蓄脓时应特别注意抗生素的选择，在治疗的过程中应首选最为敏感的抗生素合用或交替使用，以减少单个药物的使用剂量或使用时间，减缓耐药菌株的产生。抗生素治疗可与其他治疗方法结合，如局部子宫冲洗。

4.3 该研究需要说明的问题

引起昆明地区犬子宫蓄脓的病原菌，除了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之外可能还有其它菌，由于试验经费和时间的限制，试验过程中只是通过分离、鉴别和培养后将细菌分离，且仅对相对应的大肠杆菌做了生化鉴定，而严格来说每一种细菌做完分离和鉴别培养后还得做完整的生化鉴定，这样的结果才更具有说服力。

不同地区、不同时间、不同的饲养环境下犬所感染的细菌也不尽相同。此次试验由于病例数量较少，检出率还不能说明一个地区的整体问题。欲探明引起本地区犬子宫蓄脓症的优势菌，尚需收集大量病例做进一步调查研究。

目前人们大多只是使用针对葡萄球菌、大肠杆菌这二种细菌的抗生素来防治犬的子宫蓄脓，而对那些不常见的但是却可以引发犬子宫蓄脓的病原菌并未引起重视。如本次试验检测出的疑似链球菌，很少有畜主和医生了解这种细菌可以引起犬子宫蓄脓。有学者已经证实了这种细菌也可以引发犬子宫蓄脓。

5 结论

试验于昆明两处地方采回6份犬子宫蓄脓样做了细菌的分离纯化培养、部分的生化鉴定和药敏试验，共检测出36个菌株，已经鉴定出来的有24株大肠杆菌，9株疑似金黄色葡萄球菌和3株疑似链球菌等。药敏试验表明，大肠杆菌的敏感药物为恩诺沙星等，金黄色葡萄球菌的敏感药物为头孢孟多等。应联合应用喹诺酮类、头孢菌素类和氨基糖苷类药物治疗昆明地区的病例。

[1] Hardy RM, Osborne CA. Canine pyometra：pathophysiology, diagnosis and treatment of uterine and extra—uterine lesions [J]. JAAHA, 1974, 10: 245-268.

[2] Smith F O. Canine pyometra[J]. Thefiogeno1ogy, 2006, 66: 610-612.

[3] 沈磊磊, 虞耀土, 张忠杰等. 细菌分离培养和药敏试验对兽医临床用药的指导意义[J]. 浙江畜牧兽医, 2008(2): 30-31.

[4] 姚火春. 兽医微生物学实验指导[M]. 第2版. 北京: 中国农业出版社, 2001: 36-43.

[5] 胡桂学, 兽医微生物学实验教程[M].北京: 中国农业大学出版社, 2006: 47-77.

[6] 姚火春. 兽医微生物学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002: 35-37.

[7] 许丹宁, 侯振中, 樊卫东.奶牛隐性乳房炎的流行病学调查及病原菌的分离鉴定[J]. 现代畜牧兽医, 2005(9): 40-41.

[8] 张志强, 薛琴, 吕艳丽等. 犬子宫积脓的需氧菌调查及药物敏感性试验[J]. 中国兽医杂志, 2005, 41(3): 40-42.

[9] 杨白亮, 姚迪. 犬子宫蓄脓需氧菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医杂志, 2008, 44(1): 74- 76.

[10] 董龙, 金艺鹏, 刘伟等. 犬子宫积脓厌氧菌调查及动物模型的建立[J]. 中国兽医杂志, 2007, 43(5): 44-46.

（2011–11–03）

云南省高端科技人才引进计划项目子项目：PHA复合物对猪瘟疫苗和猪蓝耳病疫苗免疫效果影响,项目编号：2009C1125-6。云南省教委基金项目：苦楝皮提取物对犬蛔虫驱虫效果的研究.

通讯作者

S858.293

A

1007-1733(2012)03-0002-04