竹叶黄酮在豆浆保鲜中的应用

魏凤玉，方 菊，陈 玮，杨艳明

(合肥工业大学化学工程学院，安徽 合肥 230009)

竹叶黄酮在豆浆保鲜中的应用

魏凤玉，方 菊，陈 玮，杨艳明

(合肥工业大学化学工程学院，安徽 合肥 230009)

采用平板计数法研究竹叶黄酮(BLF)对豆浆中细菌的抑制作用和保鲜效果。结果表明：4℃时添加0.01% BLF对豆浆的保鲜效果较好，而30℃时BLF的最佳用量为0.015%；感官评定结果显示，添加0.01%～0.015%的BLF对豆浆的色泽和风味均无不良影响，且可使保质期延长6h；香兰素与BLF对豆浆的保鲜效果具有一定协同作用，30℃时添加0.015% BLF与香兰素质量比为4:1的复合保鲜剂，可使豆浆的保质期延长8h。

竹叶黄酮；豆浆；香兰素；天然保鲜剂

豆制品富含蛋白质、钙等无机盐和各种维生素，营养丰富易消化，为中国人最喜爱的食品之一。目前常采用添加化学防腐剂苯甲酸、山梨酸等[1]对豆制品进行保鲜，但它们可能对产品的口感产生不良的影响，且化学添加剂可能会对人体产生一定的毒副作用。随着人们对食品安全性的要求日趋增高，食品防腐剂的天然化、营养化己成为保鲜技术的发展趋势。

竹叶黄酮具有抗自由基、抗氧化等生物活性作用[2-5]，并对常见食物腐败菌-金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、啤酒酵母和青霉菌有较好抑菌活性[6-7]，因此研究人员探索将其用于食品的防腐保鲜。楼鼎鼎等[8]探索了竹叶黄酮在中式香肠中的应用效果，发现添加0.01%～0.02%的竹叶黄酮能显著增强产品抗氧化性能，且对中式香肠的色泽、风味和口感均无不良影响；Zhang Yu等[9]将竹叶提取物应用于薯片、炸薯条等膨化食品，研究表明当添加0.1%竹叶提取物时，可使食品中丙烯酰胺的含量降低74.1%，同时改善产品的抗氧化性能。竹叶黄酮具有良好的药理活性、极低的毒副作用[10]和清新甜香的独特风味，作为高效低毒、经济实用的食品防腐剂具有广阔的应用前景。本实验将竹叶黄酮(bamboo leaves flavonoids，BLF)应用于豆浆中，结合低温和常温保存，考察其防腐抗菌效果；并将BLF与香兰素复配，考察常温下对豆浆保鲜效果的影响，为开发豆制品的天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜毛竹叶采自安徽省六安市；芦丁对照品(纯度99.99%) 中国药品生物制品检定所；牛肉膏、蛋白胨、琼脂、黄豆 市售；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LRHS-150B恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；SF-CJ-1净化工作台 上海三发科学仪器有限公司；LB-50L立式圆形压力蒸汽灭菌锅 华凌医疗设备制造有限公司；ACQUITY UPLC高效液相色谱仪 美国Waters公司；722P可见分光光度计 上海光谱仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 竹叶黄酮制备和分析方法

准确称取洗净、烘干、粉碎过20目筛的竹叶粉末3.0g，按固液比1:18(g/mL)加入60%乙醇溶液，在70℃热回流提取3次，时间分别为2.5、1.5、1.0h，合并提取液。经絮凝除杂后过滤、浓缩除溶剂，用蒸馏水溶解。再将竹叶黄酮水溶液过AB-8大孔树脂柱吸附，90%乙醇水溶液洗脱，洗脱液旋蒸回收溶剂，将浓缩液烘干，所得固态物质用于HPLC-MS分析，鉴定出BLF中含有4种黄酮物质，分别为荭草苷或异荭草苷、芦丁、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷和槲皮素-3-O-β-D-glu(1-2)-α-L-鼠李糖苷，总含量达78.21%。实验以芦丁为对照品，采用分光光度法[11]测定BLF中的黄酮含量。

1.3.2 BLF对豆浆保鲜的实验

竹叶黄酮具有广谱抗菌作用，对食源性菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、β-嗜碱芽孢杆菌等均有显著的抑制作用[6-7]。根据文献[12]报道的竹叶黄酮对大肠杆菌的最小质量分数及课题组前期的实验结果，确定豆浆中BLF的质量分数(以芦丁质量计，下同)为0.003%、0.01%、0.015%、0.02%。实验将BLF以不同质量分数添加到新鲜豆浆中，密封后分别置于4℃和30℃保存，在不同时间内，采用GB 4789.2—2010《食品微生物学检验：菌落总数测定》中的平板计数法测定菌落数，以蒸馏水作对照。

1.3.3 BLF与香兰素复配对豆浆保鲜实验

香兰素(vnillin)在食品上除具有增香和定香作用外，还具有杀菌抑菌作用[13]，是一种有应用潜力的抗微生物剂，目前已应用于牛奶[14]、豆腐[15]和鲜切水果[16]等的保鲜。但vnillin的添加量不易控制，稍过量将对产品风味产生较大的影响。已有研究表明，vnillin与醛、酮和酚等物质在抗菌防腐方面有协同增效作用[17]。由于人工合成vnillin成本较低，若将其与BLF复配，可实现保鲜剂的高效、价廉、天然无毒。本实验将B LF和vnillin以质量比为1:4、2:3、3:2、4:1进行复配，控制豆浆中复配物的质量分数为0.015%，考察30℃时复配物对豆浆保鲜效果的影响。

1.3.4 评价指标

感官评价：根据豆浆在放置期间色泽、气味和组织状态3方面的变化，制定评分标准，见表1。试验参加人员10人，均为在校师生。实验考察BLF及其与vnillin复配物对豆浆不同时间感官的影响，4℃实验组(EP)添加0.01% BLF，30℃实验组1(EP1)添加0.015%BLF，实验组2(EP2)添加0.015% BLF和vanillin复配物(质量比4:1)，空白组(CK)以纯豆浆作为对比。

表1 豆浆感官评定标准Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of soybean milk

2 结果与分析

2.1 BLF对抑菌率的影响

表2 BLF 质量分数对抑菌率的影响Table 2 Effect of BLF concentration on antibacterial efficacy%

由表2可知，30℃时BLF对豆浆的抑菌效果明显好于4℃，这可能是由于低温下菌的生长速度较慢，BLF对其抑制作用相对较小；常温30℃时食源性菌生长较为活跃，使BLF抑菌效果得到了表现，从而具有相对较高的抑菌率。比较不同质量分数BLF对豆浆的保鲜效果可看出，BLF质量分数越高，其抑菌效果越好，但加入0.02% BLF后豆浆的色泽较深，呈灰黄色，与纯豆浆的色泽有较大的差别。实验还发现，添加BLF后豆浆的pH值几乎不变，综合考虑，确定4℃和30℃时BLF的添加量分别为0.01%、0.015%。

2.2 BLF与香兰素复配对抑菌率的影响

从图1可看出，纯vnillin在豆浆中的抑菌作用明显低于纯BLF，且vnillin的抑菌率随时间变化不明显，而BLF的抑菌率则随着时间的延长而提高，这说明BLF的抑菌作用具有较好的持久稳定性，对于食品的长时间保鲜有一定的应用价值。在vnillin中添加BLF后，其抑菌效果增加，且复配液中BLF浓度越高，其抑菌效果越好，但当复配液中BLF含量低于80%时，其抑菌效果虽然好于纯vnillin但比纯BLF还低；只有当复配液中BLF含量为80%时，抑菌效果最好。表明BLF和vnillin对豆浆的保鲜有一定的协同增效作用，可能是由于BLF和vnillin对菌的抑制作用和机理不同，vnillin对豆浆前期生长出的菌有较强的抑制性，而BLF的抑菌效果则表现为中后期。综合对比，选取BLF和vnillin的最佳复配比为4:1。

图1 BLF与Vnillin的复配比对抑菌率的影响Fig.1 Effect of BLF-to-vanillin ratio on antibacterial efficacy

2.3 豆浆的感官评价

根据表1感官评定标准，6～9分时，豆浆呈均匀的淡黄色且有豆香味，可供食用，在保质期内。据此，从表3可知，4℃时纯豆浆的保质时间约为14h，而加入BLF后，豆浆在20h时仍具有豆香味、未出现分层现象，在20～24h期间开始出现腐败现象，颜色变深、有异味产生，40h时豆浆已变成灰黄色、有强烈的氨味、出水分层严重，完全腐败，即添加0.01% BLF的豆浆保质时间达20h，比纯豆浆延长了6h。温度升高，豆浆腐败的速率加快，保鲜时间缩短。30℃时纯豆浆的保质时间约为8h，而加入BLF后，豆浆在14h时仍具有豆香味，未出现分层现象，在14～22h期间开始出现腐败现象(图2)，即添加0.015%的BLF的豆浆保质时间约为14h左右，延长了6h；添加0.015% BLF和Vanillin复配液后，豆浆的保质时间约为16h左右，延长了8h。

图2 30℃时豆浆中加入BLF与vanillin复配物20h后的照片Fig.2 Photos of soybean milk stored at 30℃ for 20 h after addition of BLF-vanillin mixture

2.4 竹叶黄酮抑菌机理的探讨

因豆浆在存放过程中产生的菌落数较多，因此总菌落数取以10为底的对数作为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制豆浆中菌的生长曲线。从图3a可知，4℃时细菌的生长曲线呈现双增长峰，BLF对豆浆中菌落的生长规律没有改变。菌落在0～14h处于对数生长期，14～20h处于稳定期，20～24h处于衰亡期，而24～40h期间豆浆菌落数突增，再次出现生长高峰。此规律与瓶装饮用纯净水中细菌数量变化的研究结果极其相似[18]。这可能是豆浆中两种不同类型腐败菌生长结果的累加。李博等[19]研究表明，豆制品在放置的不同时期，其内部的主要微生物不同。新鲜豆浆中主要以芽孢杆菌为主，放置24h后以屎肠球菌为主；新鲜豆浆中含有大量的蛋白质，芽孢杆菌分解蛋白质的能力较强，因而能利用蛋白质生长，形成第1个生长高峰，随着蛋白质被逐渐分解，芽孢杆菌的营养物质减少，其生长进入衰亡期。而屎肠球菌则利用芽孢杆菌分解蛋白质的产物(如氨基酸等)作为营养物质，形成第2个生长高峰。由图3b可看出，30℃时添加0.01%BLF后豆浆中菌落的生长规律同豆浆原液相近，菌落在0～16h处于对数生长期，16～18h处于稳定期，18～22h处于衰退期；而添加0.015%和0.02% BLF后豆浆中菌落的生长受到了明显抑制，对数生长期缩短，14h即到达稳定期，16～22h处于衰退期。此时，菌落的生长曲线仅出现一个高峰，符合菌落的一般生长周期[20]，若持续考察22h后豆浆中菌的生长情况，可能也会出现与4℃时相同的现象，形成第2个生长高峰。

表3 豆浆的感官评价结果(n=10)Table 3 Sensory evaluation results for soybean milk (n=10)

抗微生物物质的作用方式主要有以下几种：损伤细胞壁；改变细胞的通透性；改变蛋白质和核酸分子，抑制酶的作用；作为抗代谢物，抑制核酸的合成等[21]。从图3还可知，添加一定量的BLF后豆浆中的菌落数降低，表明BLF对菌的生长繁殖和代谢可能均产生了一定的影响，抑制作用发生在指数生长期。结合竹叶黄酮的结构和抗微生物的作用机制，推测BLF的抑菌机理主要有两种可能：1)BLF为黄酮类物质，易与糖类结合生成黄酮苷，从而能够水解细菌细胞壁中的糖苷键，破坏细胞壁结构，使其失去对细胞的保护作用，造成菌体死亡[22]；2)BLF分子中既有亲水性基团羟基和疏水基团，亲水性基团可以与细菌细胞膜磷脂上的磷酸基形成复合物，而疏水基团可以插入膜的脂肪酸链之间，解聚细胞膜的结构，使细胞膜的通透性增加，细胞破裂死亡[20]。有关BLF的详细抑菌机理，有待进一步探索研究。

图3 BLF对豆浆中菌落生长曲线的影响Fig.3 Effect of BLF on growth curve of bacteria in soybean milk

3 结 论

竹叶黄酮对豆浆中的微生物有较好的抑制作用，同时对产品的色泽、质地及其他感官品质无不良影响。当BLF在豆浆中的添加量为0.01%～0.015%时，可使豆浆的保质期延长6 h；香兰素在豆浆中的抑菌作用弱于BLF，但将两者复配对豆浆的保鲜效果具有一定的协同作用。30℃时添加0.015%的BLF与香兰素质量比为4:1的复合保鲜剂，可使豆浆的保质期从8h延长至16h，增加了8h。竹叶黄酮以其良好的抑菌性、安全无毒和独特清香，将在豆制品和其他食品的防腐保鲜上具有良好地应用前景。

[1]吴晖, 吴涛, 陈子敬. 新型豆腐保鲜技术的研究[J]. 现代食品科技,2005, 21(2): 1-4.

[2]夏玉红, 董普文, 钟耕. 竹叶提取物的研究开发现状[J]. 中国食品添加剂, 2009, 1(2): 77-80.

[3]MACWAN C, PATEL H V, KALIA K. A compartive evaluation ofin vitroantioxidan properties of bamboo bamnusa arundinacea leaves extracts[J]. Journal of Cell and Tissue Research, 2010, 10(3): 2413-2418.

[4]YANG Fuchu, WU Kuohui, LIU Mingjie, et al. Evaluation of the antibacterial efficacy of bamboo charcoal/silver biological protective material[J]. Materials Chemistry and Physics, 2009, 113(1): 474-479.

[5]VIJAY K S, RAHUL S, SATISH V, et al. Antibacterial activity of leaves of bamboo[J]. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2010,1(2): 1-5.

[6]陈彦, 林晓艳. 箭竹叶提取物的抗微生物作用[J]. 食品科学, 2006,27(5): 64-67.

[7]ZHANG Jianyou, GONG Jinyan, DING Yuting, et al. Antibacterial activity of water-phase extracts from bamboo shavings against food spoilage microorganisms[J]. African Journal of Biotechnology, 2010, 9(45): 7710-7717.

[8]楼鼎鼎, 梁燕, 张英, 等. 竹叶抗氧化物在中式香肠中的应用研究[J].食品科学, 2004, 25(11): 189-191.

[9]ZHANG Yu, CHEN Jie, ZHANG Xiaoling, et al. Addition of antioxidant of bamboo leaves (aob) effectively reduces acrylamide formation in potato crisps and french fries[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(2): 523-528.

[10]LU Baiyi, WU Xiaoqin, SHI Jiayi, et al. Toxicology and safety of antioxidant of bamboo leaves. Part 2: developmental toxicity test in rats with antioxidant of bamboo leaves[J]. Food and Chemical Toxicology,2006, 44(10): 1739-1743.

[11]刘江雏, 周荣琪. 竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进[J]. 食品科技, 2005, 30(7): 76-78.

[12]吴耀辉, 曾超珍, 龚燕飞. 挂绿竹竹叶提取物的抗菌作用[J]. 食品科技, 2008, 33(1): 194-196.

[13]IOANNIS M, SPYROS K, NICK K, et a1. Thermal oxidation of vanillin affects its antioxidant and antimicrobial properties[J]. Food Chemistry,2009, 114(3): 791-797.

[14]赵建芬, 韦寿莲, 严子军. 香兰素的抑菌性及其应用的初步研究[J].微生物学杂志, 2009, 29(6): 73-76.

[15]高蕙文, 冯华刚, 董明盛. 豆腐生产质量控制与保鲜研究[J]. 江西农业学报, 2008, 20(5): 94-97.

[16]VASANTHA H P, JEANINE B B, JOSEPH A O, et a1. Vanillin inhibits pathogenic and spoilage microorganismsin vitroand aerobic microbial growth in fresh-cut apples[J]. Food Research International,2006, 39(5): 575-580.

[17]杜世祥. 我国传统香料香精的防腐功能[J]. 中国食品添加剂, 1999,1(3): 33-37.

[18]马群飞. 瓶装饮用纯净水细菌数量变化规律研究[J]. 食品科学, 2000,21(9): 52-54.

[19]李博, 籍保平. 葡萄糖酸内酯豆腐生产过程中微生物的变化及豆腐中主要腐败菌的鉴定[J]. 食品科学, 2006, 27(5): 77-82.

[20]周长林, 查永喜. 微生物学[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2004:198-202.

[21]GALATI E M, MONDELLO M R, GIUFFRIDA D, et al. Chemical characterization and biological effects of SicilianOpuntia ficus indica(L.) Mill. fruit juice: antioxidant and antiulcerogenic activity [J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(17): 4903-4908.

[22]杨其蒀. 天然药物化学[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2001: 55-58.

Application of Bamboo Leaf Flavonoids for Preservation of Soybean Milk

WEI Feng-yu，FANG Ju，CHEN Wei，YANG Yan-ming
(School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of bamboo leaf flavonoids (BLF) on bacterial inhibition and quality preservation of soybean milk was investigated by plate culture count in the present study. The addition of 0.01% (wt %) BLF has an obvious fresh-keeping effect on soybean milk during storage at 4 ℃, and the optimal BLF dose for preserving soybean milk at 30 ℃ was 0.015% (wt %). Sensory evaluation displayed that 0.01%－0.015% (wt %) of BLF had no impact on the color and flavor of soybean milk, and BLF could prolong its preservation time from 8 h to 14 h. A synergistic effect of vanillin and BLF against spoilage microorganisms in soybean milk was also achieved. The shelf life of soybean milk stored at 30 ℃ could be prolonged from 8 h to 16 h when 0.015%(wt %) of BLF and vanillin mixture (at a mass ratio of 4:1) was applied.

bamboo leaf flavonoids；soybean milk；vanillin；natural preservative

Q946.841

B

1002-6630(2012)18-0312-04

2011-09-02

国家大学生创新性实验计划项目(091035947)

魏凤玉(1963—)，女，教授，博士，研究方向为化工传质与分离。E-mail：weifyliuj@yahoo.com.cn