红枣多酚氧化酶酶促褐变控制研究

倪文兵，童军茂

（石河子大学食品学院，新疆石河子 832000）

红枣多酚氧化酶酶促褐变控制研究

倪文兵，童军茂*

（石河子大学食品学院，新疆石河子 832000）

确定了红枣多酚氧化酶最适pH为6.0～6.5，最适温度为27℃;其对pH和温度较为敏感，通过调节pH和适当的热处理即可有效抑制其活性。同时在上述最适条件下，研究了以柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠作为抑制剂对红枣多酚氧化酶的抑制作用，并在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对复合抑制剂的复配进行了优化，获得最佳添加配比为:柠檬酸0.24%，抗坏血酸0.14%，亚硫酸钠0.08%;此条件下红枣多酚氧化酶相对残余酶活为0.51%。

多酚氧化酶，抗坏血酸，响应面，复配抑制剂

在果蔬加工过程中，酶促褐变是引起颜色变化的原因之一，而多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）则是引起酶促褐变的主要酶［1］。红枣（Ziziphus jujube M ill.）又名大枣、大红枣，未成熟时为黄绿色，成熟后呈红色，主产于我国，具有很高的营养保健价值;其酶促褐变主要是由于红枣组织中的多酚氧化酶催化酚类物质氧化形成醌类物质，醌类物质聚合生成黑色素，造成果实组织褐变，从而影响红枣加工制品的感官品质。本研究以新疆和田大枣为对象，确定大枣酶促褐变的控制方法，并选用柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠作为大枣多酚氧化酶活性的抑制剂，通过运用响应面分析法对大枣多酚氧化酶抑制剂的复配进行优化，从而获得防褐变效果较优的复合抑制剂，为红枣深加工过程中褐变的控制提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣 购于新疆阿克苏市;邻苯二酚 天津市化学试剂三厂，分析纯;磷酸氢二钠 天津市致远化学试剂有限公司，分析纯;磷酸二氢钠、柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠 天津市巴斯夫化工有限公司，分析纯;蒸馏水 实验室提供，分析纯。

UV759紫外－可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;HH－42快速恒温数显水箱 常州国华电器有限公司;MA110分析天平 上海第二天平仪器厂;EL204电子天平 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司;Neofuge 15R台式高速冷冻离心机力康发展有限公司;HI8424便携式pH测定仪 哈纳仪器有限公司;JJ－2组织捣碎机 上海比朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程 红枣→筛选、清洗→去皮、去核→捣碎匀浆→高速离心→多酚氧化酶活性测定

1.2.2 红枣多酚氧化酶的制备 红枣清洗后沥干，去核去皮，在 4℃下取 100g红枣果肉组织加入400m L蒸馏水，组织捣碎机匀浆2m in，然后在4℃、10000 r/m in条件下冷冻离心30m in，分离上清液，即为酶液，低温保存备用。

1.2.3 红枣多酚氧化酶的测定 采用分光光度法，取制备的红枣多酚氧化酶酶液，以邻苯二酚作为反应底物，在420nm波长下测定反应体系的吸光度，并计算多酚氧化酶酶活及相对残余酶活。吸光度越大，表明褐变越严重。

酶活力定义［2］:反应体系中，1m L酶液反应1m in吸光度增加0.001定义为一个酶活力单位U。

相对残余酶活［3］（%）=处理后酶液的酶活/酶液的原始酶活×100%

2 结果与分析

2.1 红枣多酚氧化酶活性随反应进程变化规律

取1m L酶液，加入3m L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，然后再加入1m L 0.1mol/L的邻苯二酚，混匀后在25℃条件下反应，每间隔1m in测一次420nm波长处反应体系的吸光值，结果如图1所示。反应在初始阶段速度很快，红枣多酚氧化酶活性随反应的进行呈直线上升;5m in后反应速度逐渐放缓，酶活有所降低，这可能与酶作用底物的消耗和产物的积累以及吸光度随时间的推移变化率减小有关，因而4m in后，随时间的增加酶的活性不能由反应进程完全表征出来，所以实验确定反应时间以4m in为最佳。另外，随着反应的进行，吸光度逐渐增大，则表明反应时间越长褐变越明显。

图1 红枣多酚氧化酶活性随反应时间的变化Fig.1 Changes of PPO activity from Chinese jujube with reaction time

2.2 反应pH对红枣多酚氧化酶的影响

取1m L酶液，加入3m L不同pH的磷酸盐缓冲溶液，再加入1m L 0.1mol/L的邻苯二酚，混匀后在25℃条件下反应4min，测定420nm波长处反应体系的吸光度。缓冲溶液分别采取 pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0十三个水平。实验结果如图2所示。红枣多酚氧化酶受pH影响较大，在pH 5.5～7.0时活性较高;通过非线性回归分析预测pH 6.3时酶活性达到最大，经实验验证可确定最适pH为6.0～6.5;当pH为4.0时红枣多酚氧化酶活性受到有效抑制，而在pH小于3.0条件下酶活几乎丧失，因而可以通过调节pH提高酸度来降低多酚氧化酶活性从而有效防止褐变。

2.3 反应温度对红枣多酚氧化酶的影响

取1m L酶液，加入3m L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，再加入1m L 0.1mol/L的邻苯二酚，混匀后在不同温度条件下反应4m in，测定420nm波长处反应体系的吸光度，结果如图3所示。红枣多酚氧化酶受温度影响较为显著，其作用的适宜温度为20～40℃，经非线性回归分析得到在27℃时活性最高，其后随着温度的增加酶活急剧降低，60℃后多酚氧化酶受高温作用逐渐失活，因而可以通过适当的热处理来有效抑制红枣多酚氧化酶的活性以达到防褐变的效果。

图2 反应pH对红枣多酚氧化酶活性影响Fig.2 Effect of reaction pH on PPO activity from Chinese jujube

图3 反应温度对红枣多酚氧化酶活性影响Fig.3 Effect of reaction temperature on PPO activity from Chinese jujube

2.4 抑制剂对红枣多酚氧化酶活性的影响

选用柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠作为多酚氧化酶活性的抑制剂，以pH 6.3的磷酸缓冲液配制不同浓度的抑制剂溶液。取1m L酶液，加入1m L不同浓度的抑制剂溶液（抑制剂的加入量以提取酶液前的红枣重量为基准）、2m L pH 6.3磷酸缓冲液，再加入1m L 1%的邻苯二酚，混匀后27℃条件下反应4m in，在420nm波长处测定反应体系的吸光度，并计算红枣多酚氧化酶相对残余酶活。

柠檬酸添加量分别取 0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%六个水平;抗坏血酸添加量分别取0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%六个水平;亚硫酸钠添加量分别取 0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.1%、0.2%六个水平。实验结果如图4～图6所示。

图4 柠檬酸添加量对红枣多酚氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of amount of citric acid on PPO activity from Chinese jujube

三种抑制剂对红枣多酚氧化酶都有一定的抑制作用，其中亚硫酸钠和抗坏血酸的抑制效果较为显著，而柠檬酸的用量相对较大，相当于在普通食品中作为酸味调节剂的用量。多酚氧化酶是以铜离子为辅基的金属蛋白酶［4］。柠檬酸对红枣多酚氧化酶活性的影响首先是通过调节反应体系的pH实现的，当添加量为0.01%时能提高多酚氧化酶活性，而随着用量的增加，反应体系pH逐渐降低从而对多酚氧化酶产生抑制效果;其次，柠檬酸含有三个羧基，对金属离子有很强的螯合作用，它能与多酚氧化酶中的铜辅基络合使酶钝化从而减缓褐变。考虑到在红枣加工过程中对制品口味的影响，以及酸度的适宜性，作为褐变抑制剂的柠檬酸的添加量选择在0.1%～0.3%。

图5 抗坏血酸添加量对红枣多酚氧化酶活性的影响Fig.5 Effect of amount of ascorbic acid on PPO activity from Chinese jujube

图6 亚硫酸钠添加量对红枣多酚氧化酶活性的影响Fig.6 Effect of amount of sodium sulfite on PPO activity from Chinese jujube

抗坏血酸对红枣多酚氧化酶具有较好的抑制作用，0.05%的添加量即有显著的防褐变效果，这是因为抗坏血酸有较强的还原性，不仅能消耗反应体系中的氧，减少不良氧化物的产生，还能还原在多酚氧化酶作用下由酚类物质产生的醌类物质，防止其进一步生成有色物质。另外，抗坏血酸是红枣的固有营养成分，安全性高，是防褐变的理想制剂。但当抗坏血酸添加量超过0.15%时，其自身又容易发生非酶促褐变，所以其添加量应适当控制，以0.05%～0.15%为宜。

亚硫酸钠对红枣多酚氧化酶的抑制作用很明显。其除了能清除反应体系中的氧外，还能与酶促褐变中间产物醌类不可逆加成生成无色物质，并且还有防止微生物污染的作用［5］。当亚硫酸钠的添加量为0.2%时，红枣多酚氧化酶的相对残余酶活为零，这可能与亚硫酸钠的漂白作用有关。由于它破坏营养，且有害健康，其使用已受到限制［6］，选择用量控制在0.1%以内。

2.5 响应面分析法优化抑制剂的复配

考虑到单一抑制剂往往不能取得理想的防褐变效果，而且用量相对较大，复合抑制剂则在一定程度上能弥补这两方面的不足。又由于柠檬酸与抗坏血酸、亚硫酸钠复合使用对多酚氧化酶的抑制效果具有协同增效作用［1］，而且亚硫酸钠也能保护抗坏血酸不被氧化［5］，复配使用抑制效果更为显著。根据单因素实验所确定的柠檬酸、抗坏血酸以及亚硫酸钠的添加量水平范围，以红枣多酚氧化酶相对残余酶活为指标，采用Design－Expert 7.1软件为实验设计分析的辅助手段，运用中心组合（Cental Composite）设计原理进行三因素五水平响应面分析实验。响应面分析因素水平见表1，响应面设计方案及实验结果见表2。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 响应面设计方案及实验结果Table 2 Program and test results of response surface analysis

通过Design－Expert7.1软件对实验结果进行二次多项式拟合以及方差分析，方差分析结果见表3，红枣多酚氧化酶相对残余酶活回归方程为:Y= 2.22－1.01A－2.69B－0.66C+0.64AB+0.087AC+ 0.64BC+0.78A2+0.86B2+0.28C2。

P值是检验回归系数的标准，当P＜0.05时表明该项指标显著。从变量和响应值之间的方差分析可知（见表3）:A、B、C、AB、BC、A2、B2达到了显著水平。在各影响因素中，一次项抗坏血酸添加量（B）影响最大，其下依次是一次项柠檬酸添加量（A）、二次项抗坏血酸添加量（B2）和柠檬酸添加量（A2）、亚硫酸钠添加量（B）以及交互项抗坏血酸钠与亚硫酸钠（BC）和柠檬酸和抗坏血酸（AB）。这表明各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。为了直观地表现复合抑制剂对红枣多酚氧化酶的抑制效果，两种抑制剂之间的交互作用见相应的响应面图，如图7～图9所示。抗坏血酸对多酚氧化酶相对残余酶活影响最为显著，其表现为曲线较陡;其次是柠檬酸，其表现为曲线较为平滑;再次是亚硫酸钠，随着添加量的增大或减小，曲线斜率变化较小。

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance in the quadraticmodel of response surface

图7 柠檬酸和抗坏血酸交互影响红枣多酚氧化酶的响应面图Fig.7 Response surface diagram of effect of interaction between citric acid and ascorbic acid on PPO activity

图8 柠檬酸和亚硫酸钠交互影响红枣多酚氧化酶的响应面图Fig.8 Response surface diagram of effect of interaction between citric acid and sodium sulfite on PPO activity

由回归模型的P＜0.0001可知，该模型高度显著，表明实验设计可靠。同时模型的可决系数和调整可决系数分别为0.9673、0.9380，说明回归方程和实验结果拟合较好，可以较好地描述各因素和响应值之间的关系，所以可以利用该回归方程确定复合抑制剂的的最佳复配参数。经计算，最佳抑制剂添加量的编码为:A=0.389，B=0.999，C=0.648;对应的抑制剂添加量分别为:柠檬酸0.24%，抗坏血酸0.14%，亚硫酸钠0.08%，此时红枣多酚氧化酶相对残余酶活为0.49%。经实验验证，此条件下测得的红枣多酚氧化酶相对残余酶活为0.51%，与理论值0.49%相差不大。与使用单一抑制剂相比，复合抑制剂对红枣多酚氧化酶的抑制作用显然增强了很多，在低添加量情况下即可达到显著的防褐变效果。

图9 抗坏血酸和亚硫酸钠交互影响红枣多酚氧化酶的响应面图Fig.9 Response surface diagram of effect of interaction between ascorbic acid and sodium sulfite on PPO activity

3 结论

红枣多酚氧化酶对pH和温度较为敏感，最适pH为6.0～6.5，最适温度为27℃，通过调节pH和适当的热处理即可有效抑制其活性。以柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠作为红枣多酚氧化酶的抑制剂，在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对复合抑制剂的复配进行了优化，获得最佳添加配比为:柠檬酸0.24%，抗坏血酸0.14%，亚硫酸钠0.08%;此条件下红枣多酚氧化酶相对残余酶活为0.51%。与使用单一抑制剂相比，复合抑制剂对红枣多酚氧化酶的抑制作用有了显著增强，在低添加量情况下即可达到显著的防褐变效果。

［1］M E M ALMEIDA，JN NOGUEIRA.The contol of polyphenol oxidase activity in fruits and vegetables［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1995，47:245－256.

［2］Serp Dogan，Pinar Turan，Mehmet Dogan，et al.Inhibition kinetics of polyphenol oxidase by glutamic acid［J］Eur Food Res Technol，2007，225:67－73.

［3］张立彦，芮汉明，刘峰.香蕉中多酚氧化酶的灭酶条件研究［J］.食品与发酵工业，2010，36（2）:105－197.

［4］杨昌鹏，黄华梅.果蔬多酚氧化酶酶促褐变的控制［J］.食品研究与开发，2008，29（10）:135－138.

［5］侯振建.食品添加剂及其应用技术［M］.北京:化学工业出版社，2004:30－31.

［6］刘红锦，徐为民，王静等.果蔬的褐变及其控制方法［J］.食品研究与开发，2008，29（4）:159－161.

Study on enzymatic browning control of polyphenol oxidase for Chinese jujube

NIW en－bing，TONG Jun－mao*

（Food College，Shihezi University，Shihezi832000，China）

Determ ined that the op tim um pH of polyphenol oxidase（PPO）for Chinese jujube was 6.0～6.5，and the op timum tem perature 27℃.Much sensitive to the tem perature and pH，the ac tivity of PPO could be effectively inhibited by app rop riate heat treatm ent and ad justing the pH.In these op timal cond itions，the test for the controlof PPO in Chinese jujube was the add ition of citric acid，ascorb ic acid，sod ium sulfite.And on the basis of one－fac tor experiments，response surface analysis was app lied for the op tim ization of m ixing inhibitors.As a result，w ith com p lex add itives of0.24%citric acid，0.14%ascorbic acid and 0.08%sod ium sulfite added，the relative residual activity of PPO was 0.51%.

polyphenoloxidase;ascorbic acid;response surface;com posite inhibitors

TS201.2+5

A

1002－0306（2012）04－0205－04

2011－01－13 *通讯联系人

倪文兵（1986－），男，在读研究生，研究方向:果蔬加工与。