脲基酰胺酶基因在黄酒酵母中的整合型表达

朱旭亚，陆 健，谢广发

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122;4.浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，浙江绍兴 312000)

脲基酰胺酶基因在黄酒酵母中的整合型表达

朱旭亚1，2，3，陆 健1，2，3，谢广发3，4，*

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122;4.浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，浙江绍兴 312000)

氨基甲酸乙酯是一种人类的潜在致癌物，在许多发酵酒中均有存在，主要来源于发酵过程中酵母代谢产生的尿素。以pYX212为载体，将脲基酰胺酶基因DUR1，2克隆到TPI强启动子和终止子之间的位点，再通过同源重组的方式将受强启动子调控的目的基因整合到黄酒酵母的基因组中，最终获得一株低产尿素的胞内脲基酰胺酶基因组成型高表达的黄酒酵母85#DUR1，2。在实验室规模的黄酒酿造实验中，85#DUR1，2产尿素量为8.34mg/L，比出发菌株降低了69.9%，贮存一段时间后的酒液中氨基甲酸乙酯含量比出发菌株降低了40.5%，而发酵性能、酒精度、总酸及氨基态氮与出发菌株无显著差异。

氨基甲酸乙酯，尿素，黄酒，脲基酰胺酶基因，酵母

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)是一种人类潜在的致癌物，在发酵食品和酒精饮料中广泛存在［1］。目前，EC的检测主要用的是 GC/MS法，通过此法检测表明，在白兰地、威士忌、中国黄酒、日本清酒和葡萄酒中，EC 含量较高［1－2］。因此，许多国家已针对葡萄酒、清酒、白兰地、威士忌等酒种制定了相应的EC限量标准，对黄酒中EC含量的控制已迫在眉睫［3－4］。黄酒中90%的氨基甲酸乙酯由尿素和乙醇反应生成，而尿素主要是在发酵过程中由酵母代谢产生［5］。酵母通过精氨酸酶(CAR1基因编码)分解精氨酸产生尿素，再通过脲基酰胺酶(DUR1，2基因编码)将尿素分解成氨和二氧化碳。研究表明，酿酒酵母在生长繁殖和进行酒精发酵时存在氮源代谢阻遏(nitrogen catabolite repression，简称 NCR)机制，即酵母会优先利用氨，当氨利用完全后才利用尿素作为氮源［6］。因此，在酒精发酵阶段，精氨酸大量水解成尿素，DUR1，2基因由于受到NCR作用，表达水平远低于CAR1，多余尿素不能被及时分解，随即被转运出细胞，使发酵液中的尿素含量大幅增加［7－9］，最终导致黄酒中形成较高量的EC。使用低产尿素的黄酒酵母可以有效地解决黄酒中EC含量过高的问题。目前，国外已有对葡萄酒酵母和清酒酵母进行低产尿素功能改造的相关报道，其中通过组成型高表达脲基酰胺酶基因进行酵母工程菌的构建被认为是最优策略。通过这种手段构建的葡萄酒酵母 522DUR1，2获 得 美 国 FDA 的 GRAS(Generally Regarded As Safe)认证，实现了商业化［10］。本研究以黄酒生产常用的酵母菌株85#为实验对象，将其脲基酰胺酶基因DUR1，2进行克隆，并通过同源重组整合到基因组中，考察获得的代谢工程菌低产尿素效果，以期为解决黄酒EC含量偏高问题提供一种有效的参考思路和方法。

表1 实验用的主要引物Table 1 Primers used in the experiment

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌E.coli JM109 实验室保存;黄酒酵母85# 浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司;质粒pPICZα 实验室保存;质粒pYX212 由江南大学生物工程学院周景文博士提供;LB培养基 0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化钠，使用前加入氨苄青霉素(工作浓度为50μg/mL)或博来霉素(即Zeocin抗生素，工作浓度为50μg/mL)，固体培养基在液体培养基中加入2%琼脂;YPD培养基 1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，使用前加入Zeocin抗生素(工作浓度为300μg/mL)，固体培养基在液体培养基中加入2%琼脂;尿素培养基 0.17%YNB(酵母无氨基氮源)、2%葡萄糖、0.1%尿素;限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、Prime Star DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒等 Takara公司;质粒小量提取试剂盒 上海生工公司;酵母基因组提取试剂盒 北京三博远志生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PCR引物的设计 根据已知的DUR1，2基因、Sh ble基因及pYX212质粒的序列，设计相应的PCR引物进行基因的扩增或重组子的鉴定，列于表1，引物由上海赛百盛公司合成。

1.2.2 表达载体pYX212－DUR1，2的构建 参照《分子克隆实验指南(第三版)》［11］，进行相关的分子操作，构建含有脲基酰胺酶基因编码框的重组表达质粒pYX212－DUR1，2。构建的质粒送Takara公司测序鉴定。

1.2.3 共转质粒pYX212－Sh ble的构建 参照《分子克隆实验指南(第三版)》［11］，构建含抗生素标记的选择载体 pYX212－Sh ble。

1.2.4 黄酒酵母的转化 参照文献［12］，采用醋酸锂法，将表达载体pYX212－DUR1，2线性化后与质粒pYX212－Sh ble共转化黄酒酵母85#。

1.2.5 酵母阳性转化子的筛选、鉴定 随机挑取平板上的转化子，先用引物P5/P6进行PCR鉴定，以确定目的基因是否进入酵母细胞。对于阳性结果的转化子进行划线转接，再用试剂盒提取其基因组，以此为模板，P5/P2为引物进行PCR扩增，二次鉴定，验证目的基因整合位点是否正确。

1.2.6 尿素消耗实验 将经PCR鉴定获得的阳性转化子和初始菌株分别接种于YPD液体培养基中，30℃培养20h，分别取等量培养液以1∶100的比例转接到尿素培养基中，30℃振荡培养。24h后分别取1mL培养液，测定其中尿素的含量。此实验可快速检测酵母转化菌株分解尿素的能力，以对酵母阳性转化子进一步鉴定，验证其低产尿素效果。

1.2.7 黄酒发酵实验 分别采用获得的改造菌株与初始菌株进行黄酒的小试发酵，方法为:称取100g大米，浸米、蒸饭，摊饭冷却，加麦曲和水拌饭，添加量为:麦曲15g、水170g，然后再加适量糖化酶，按照10%接种量接入黄酒酵母，30℃主酵4d，15℃后酵15d，每个菌株做三次重复。对于发酵获得的酒液，煎酒过滤后于4℃贮存，并进行相关指标的测定。总糖、总酸、酒精度、氨基态氮按照黄酒国标(GB/T 13662－2008)进行测定，尿素参照相关文献［13］，采用比色法进行测定，EC 采用 GC－MS 测定［14］。

1.2.8 遗传稳定性实验 将获得的黄酒酵母工程菌进行实验室规模的发酵实验，连续传代发酵5次，考察其低产尿素遗传性状的稳定性。

2 结果与分析

2.1 表达载体pYX212－DUR1，2的筛选及鉴定

从含有氨苄青霉素的LB平板上挑取大肠杆菌转化子，以其为模板，以P1/P2为引物进行快速菌落PCR鉴定，再以鉴定阳性的单菌落进行质粒抽提，酶切验证。结果如图1，用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切重组质粒后，得到了两个片段，分别约5.5kb和8.3kb，大小与目的基因及空载体酶切后大小一致，证明目的基因片段插入正确。测序结果与GeneBank中报道的序列进行比对，DUR1，2基因编码框内第532位碱基由T变为C，但编码的氨基酸序列不变，因此符合要求。将获得的重组质粒命名为pYX212－DUR1，2。

2.2 共转质粒pYX212－Sh ble的筛选及鉴定

图1 重组质粒pYX212－DUR1，2的EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切验证Fig.1 The restriction analysis of plasmid pYX212－DUR1，2 by EcoRⅠ/BamHⅠ

从含有氨苄青霉素的LB平板上挑取大肠杆菌转化子，以其为模板，以P3/P4为引物进行快速菌落PCR鉴定，再用阳性转化子的单菌落，提质粒酶切验证。如图2，EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒后获得了约0.4kb和8.3kb的两个片段，与Sh ble基因和pYX212质粒双酶切后的片段大小相符，证明Sh ble基因已正确插入质粒pYX212内部。

图2 重组质粒pYX212－Sh ble的EcoRⅠ/HindⅢ双酶切验证Fig.2 The restriction analysis of plasmid pYX212－sh ble by EcoRⅠ/HindⅢ

2.3 酵母转化及转化子的筛选、鉴定

将重组质粒 pYX212－DUR1，2用 BglⅡ线性化后，与共转质粒pYX212－Sh ble共转黄酒酵母85#，使目的基因通过同源重组整合到酵母的基因组中，如图3。

图3 重组黄酒酵母85#DUR1，2的构建Fig.3 Construction of recombinant yeast 85#DUR1，2

在含Zeocin抗生素的YPD平板上挑取酵母转化子，以P5/P6为引物进行快速菌落PCR鉴定，发现较多转化子能扩增出771bp的目标条带，初步断定目的基因转入酵母胞内(见图4A)。以这些酵母转化子的基因组作为模板，以P5/P2为引物进行二次PCR验证，获得1株转化子可扩增出目标条带(TPI启动子－DUR1，2编码框区域)，将这株酵母转化子命名为 85#DUR1，2(见图 4B)。

图4 酵母转化子的PCR鉴定Fig.4 PCR identification of yeast transformants

2.4 尿素消耗实验结果

将 85#、85#DUR1，2同时进行尿素消耗实验，进一步验证二次PCR鉴定获得的菌株是否符合要求，结果发现85#DUR1，2菌株分解尿素的能力明显高于85#菌株(见图5)，证明其脲基酰胺酶基因得到高表达。

图5 工程菌株与出发菌株24h尿素消耗对比Fig.5 The comparison of urea degradation in 24 hours between the engineering and parental strains

2.5 黄酒发酵结果

对发酵后的黄酒进行相关指标的测定，结果如表2。从表2可以看出，与出发菌株相比，改造菌株酿造的黄酒在总糖、酒精度、总酸和氨基态氮方面没有明显的差异，而尿素和EC含量却显著降低，分别比出发菌株降低了69.9%和40.5%，说明改造菌株在不改变出发菌株发酵性能的前提下，能显著降低其产尿素的能力，对降低黄酒中EC的含量具有较好的效果。

2.6 遗传稳定性实验

对获得的黄酒酵母工程菌85#DUR1，2进行了连续5次的传代发酵，测定每代酵母产尿素情况，发现5代酵母工程菌株与0代酵母工程菌株的产尿素含量均在8.21～9.08mg/L之间，无明显变化，证明该菌株有较好的遗传稳定性。

3 结论

本研究通过组成型高表达脲基酰胺酶基因，构建了一株低产尿素且遗传稳定的黄酒酵母代谢工程菌。与出发菌株相比，其尿素产量降低了69.9%，酿造的酒液贮存一段时间后，EC含量降低了40.5%，而其他发酵指标基本不变。

［1］夏艳秋，朱强，汪志君.谨防黄酒中氨基甲酸乙酯的危害［J］.酿酒，2004，31(3):51－53.

［2］梁新红，赵瑞香，周全霞.酒精饮料中氨基甲酸乙酯检测方法研究进展［J］.食品工业科技，2010，31(8):400－403.

［3］Fu M L，Liu J，Chen Q H，et al.Determination of ethyl carbamate in Chinese yellow rice wine using high－performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］ .International Journal of Food Science and Technology，2010，45(6):1297－1302.

［4］石维妮，刘晓毅，赵玉琪，等.发酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量调研［J］.中国酿造，2009(11):124－126.

［5］顾国贤.酿造酒工艺学［M］.第二版.北京:中国轻工业出版社，2008.

［6］Hofman－Bang J.Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular Biotechnology，1999，12(1):35－73.

［7］Genbauffe F S，Cooper T G.Induction and repression of the urea amidolyase gene in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular Cell Biology，1986，6(11):3954－3964.

［8］Coulon J，Husnik J I，Inglis D L.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae to minimize the production of ethyl carbamate in wine［J］.American Journal of Enology and Viticulture，2006，57(2):113－124.

［9］Dahabieh M S.Metabolic engineering of industrial yeast strains to minimize the production of ethyl carbamate in grape and sake wine［D］.The University of British Columbia，2008.

［10］Dahabieh M S，Husnik J I，Vuuren H J J.Functional enhancement of Sake yeast strains to minimize the production of ethyl carbamate in Sake wine［J］.JournalofApplied Microbiology，2010，109(3):963－973.

［11］Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.分子克隆实验指南［M］.金冬雁，黎孟枫，译.第三版.北京:科学出版社，2002.

［12］Gietz R D，Woods R A.Transformation of yeast by lithium acetate /single－stranded carrier DNA /polyethylene glycol method［J］.Methods in Enzymology，2002，350:87－96.

［13］王立媛，冯靓，吴平谷，等.分光光度法测定黄酒中尿素含量［J］.中国卫生检验杂志，2010(11):3059－3061.

［14］钟其顶，姚亮，熊正河.采用GC/MS和HPLC－FLD两种方法测定黄酒中的 EC含量［J］.食品与发酵工业，2007，33(3):115－119.

Constitutive expression of DUR1，2 gene in Chinese rice wine yeast

ZHU Xu－ya1，2，3，LU Jian1，2，3，XIE Guang－fa3，4，*
(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;4.Zhejiang Guyue Longshan Shaoxing Wine Co.，Ltd.Shaoxing 312000，China)

Ethyl carbamate(EC)is a potential carcinogen for human，which can be found in many fermented alcoholic beverages.The main precursor for EC is urea produced by yeast.The DUR1，2 gene which encoded urea amidolyase was cloned into plasmid pYX212 between the TPI promoter and terminator sites to form the DUR1，2 expression cassette.The cassette was then integrated into the genome of the Chinese rice wine yeast 85#.Thus a urea－ degrading Chinese rice wine yeast 85#DUR1，2was obtained.According to the laboratory scale rice wine brewing tests，urea was reduced to 8.34mg/L by yeast 85#DUR1，2，69.9%less than the parental strain，while the ethyl carbamate level was 40.5%less than that of the parental strain after a period of storage.Meanwhile，85#DUR1，2was substantially equivalent to its parental strain in terms of fermentation ability，ethanol，total acid and amino nitrogen.

ethyl carbamate;urea;Chinese rice wine;DUR1，2 gene;yeast

Q786

A

1002－0306(2012)17－0173－04

2011－12－28 *通讯联系人

朱旭亚(1987－)，女，在读硕士研究生，研究方向:发酵工程。

绍兴市科技计划项目(2009A21025)。