米曲霉固态发酵降解大豆致敏原条件的优化

黄 颖，钱 和，*，汪何雅，张伟国，毕井辉

(1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122;2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122)

米曲霉固态发酵降解大豆致敏原条件的优化

黄 颖1，钱 和1，*，汪何雅1，张伟国2，毕井辉1

(1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122;2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122)

为了最大程度地降低甚至消除米曲霉固态发酵豆粕产品的免疫反应性，此研究利用响应面法对米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的条件进行了优化。首先对影响米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的几个因素(发酵时间、接种量、发酵温度、培养基初始pH、料水比)进行了单因素研究，确定了对结果有较大影响的料水比、发酵温度和培养基初始pH这三个因素。其后利用Box－Behnken设计，确定了固态发酵的最佳条件，即当料水比为1∶1.21(g/mL)、发酵温度29.8℃、pH为6.63时，得到理论最低致敏原降解率为99.15%。最后，经验证实验，最佳条件下实际平均致敏原降解率为99.02%。验证实验结果与理论值相差0.13%，说明该方程与实际情况拟合较好。

大豆致敏原，降解，米曲霉，固态发酵，响应面法

大豆这一经济的植物蛋白资源因其丰富的营养价值和优良的加工特性被广泛应用于食品工业。但是，近年来大豆因其引发的食物过敏反应逐渐增多，已被世界粮农组织与世界卫生组织列为八大食品致敏原之一［1］。截止到2010年4月16日，致敏原数据库已收录38种大豆过敏原［2］。目前，对于大豆过敏患者而言，杜绝摄入含有大豆成分的食品是其避免引发过敏反应的最佳途径。然而，随着食品种类多样性以及食品成分复杂性的情况日益凸显，降低甚至去除大豆类食品中大豆致敏原的致敏性，则成为当前急需解决的问题。微生物发酵可以提高食品的营养性和功能性。蛋白经过微生物发酵后转化为小分子多肽及氨基酸，因此它可以作为降解食品过敏蛋白的一种研究方法。Tsuji、Kobayashi和Yamanishi等［3－5］的研究发现，豆类食品在发酵过程中微生物产生蛋白酶，其可以将大豆中的主要过敏蛋白(Gly m Bd 30K)水解成多肽，从而降低其致敏性。另外，胡晓萍［6］和 Frias等［7］用不同微生物对大豆粉或破碎的大豆进行发酵，发现发酵产物的免疫反应性均有不同程度地降低。目前国内外大豆脱敏的研究大多集中在物理、化学法和酶法方面［8－10］，在发酵法降低大豆过敏原方面的信息还很少［11］，发酵法降低或脱除大豆蛋白抗原性的研究仍然需要进一步探索。基于先前运用不同菌种固态发酵豆粕降解大豆致敏原的初步筛选结果，本研究通过单因素实验和响应面分析对其中效果相对显著的米曲霉进行发酵条件优化，以期最大程度地降解大豆致敏原，为生产低敏甚至脱敏的大豆发酵产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

非转基因大豆粕 食品级，秦皇岛金海食品工业有限公司，水分11.13%、蛋白质 48.45%、灰分7.17%;米曲霉(Aspergillus oryzae) 江南大学生物工程学院代谢调控与代谢工程研究室保藏菌种;斜面培养基 马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，0.1MPa灭菌20min;发酵培养基 250mL三角瓶中豆粕10g，料水比1.0∶1.0，初始 pH 为 7.0，0.1MPa灭菌 20min;96孔聚苯乙烯酶标板 美国Costar公司;羊抗兔HRP标记抗体IgG Sigma公司;EL－TMB显色试剂 上海生工生物工程有限公司。

立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司;生物安全柜 北京东联哈尔仪器制造有限公司;霉菌培养箱 上海精宏实验设备有限公司;ALPHA 1－4 LSC冷冻干燥机 德国Christ公司;Eppendorf 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司;Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo公司;隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂;水浴恒温振荡器 无锡沃信仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将米曲霉斜面保藏菌种接种于PDA斜面，28℃恒温培养72h。

1.2.2 孢子悬浮液制备 用无菌生理盐水冲洗活化好的米曲霉斜面并且适当稀释后，通过血球计数板计数，将孢子菌悬液的浓度调整为4×108个/mL，4℃保存备用。

1.2.3 米曲霉固态发酵豆粕条件优化 首先通过单因素实验，见表1，在接种量、培养基初始 pH、料水比、发酵温度、发酵时间等众多因素中筛选出对降解大豆致敏原有显著影响的因素。然后在单因素实验的基础上，采用Box－Behnken Design(BBD)，以筛选出的因素为自变量，以发酵豆粕中大豆致敏原降解率为响应值，根据Design－Expert V8.0.6软件所提供的实验表进行实验，见表2、表3，并运用此软件对实验数据进行回归拟合和方差分析，从而得出各自变量水平的最优值，以确定米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的最佳工艺条件。

表1 单因素实验设计Table 1 Single factor experiment design

1.2.4 验证实验 根据单因素实验和Box－Behnken实验所得优化结果进行验证实验，以验证在米曲霉的最优发酵条件下，发酵豆粕中大豆致敏原降解率的实测值与回归模型预测值的拟合度。

1.2.5 豆粕中大豆致敏原的提取 原豆粕和发酵豆粕经冷冻干燥后，粉碎过60目筛，豆粕粉中大豆致敏原的提取采用先变性提取后复性处理［12－13］的方法。具体步骤如下:称取1g豆粕粉于50mL圆底离心管中，加入 5mL Tris－HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.6)，37℃，150r/min提取1h。然后加入15mL变性剂，即含有13mol/L尿素、0.02mol/L DTT的Tris－HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.6)，充分混匀并将pH校正为8.6后，放入恒温水浴振荡器中，100℃，150r/min变性提取1h，再置于50℃水浴锅内。随后用180mL已预热至50℃的复性剂(0.055mol/L NaCl、7.4mmol/L胱氨酸，pH9.0)，将离心管中的提取液转移至250mL锥形瓶内以复性。复性结束后，将样品冷却至室温，过滤，滤液分装贮存于－20℃待测。

1.2.6 发酵前后大豆致敏原的检测 依照1.2.5中所述方法从原豆粕中大量提取大豆致敏原经冷冻干燥制得标准抗原。发酵前后大豆致敏原的检测采用间接竞争 ELISA 法［14］。

1.2.6.1 包被 标准抗原经pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为0.5μg/mL，100μL包被于96孔酶标板中，4℃放置16h。

1.2.6.2 竞争抗原与抗体的预反应 以含0.1%牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4的PBS)为稀释液，将标准抗原及样品进行一系列稀释后加入反应管中，并等体积加入1∶30000稀释的一抗，微型振荡器上混匀后，于4℃放置16h。同时以稀释液代替样品加入反应管中与等体积抗体混合作为阴性对照，稀释液作为空白对照。

1.2.6.3 洗涤 用含有0.1%吐温20的PBS溶液(PBST)洗板 3 次，300μL/孔，每次 3min，拍干。

1.2.6.4 封闭 以含有1%BSA的PBS溶液作为封闭液加入酶标板中，200μL/孔，37℃恒温箱封闭2h。1.2.6.5 洗涤 同1.2.6.3。

1.2.6.6 加样反应 将1.2.6.2中经过预反应的抗原抗体混合物、阴性对照、空白对照加入酶标板，100μL/孔，37℃恒温箱孵育 2h。

1.2.6.7 洗涤 同1.2.6.3。

1.2.6.8 加酶标二抗:向酶标板中加入5000倍PBST稀释的羊抗兔HRP标记抗体IgG，100μL/孔，37℃恒温箱孵育1h。

1.2.6.9 洗涤 方法同1.2.6.3，洗涤5次。

1.2.6.10 显色 每孔加入100μL TMB显色液，37℃恒温箱中避光显色20min。

1.2.6.11 终止测定 每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应后，于酶标仪检测其OD450值。

1.2.6.12 数据处理 根据标准曲线，计算出发酵前后豆粕中大豆致敏原含量［10］，大豆致敏原降解率(%)=(1－发酵豆粕中大豆致敏原含量/原豆粕中大豆致敏原含量)×100

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 接种量对致敏原降解率的影响 当培养基初始pH为7.0，料水比为1.0∶1.0(g/mL)时，分别接入1mL不同浓度的孢子悬浮液，于30℃霉菌培养箱中发酵96h，考察不同接种量对米曲霉降解大豆致敏原的影响，结果见图1。

图1 接种量对米曲霉降解大豆致敏原的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

豆粕发酵时，一定范围内，适当地增大接种量可以缩短发酵周期，加速代谢产物的形成，尤其是蛋白酶系的产生，可以使豆粕蛋白得到最大程度的水解，从而也加大了对致敏原中抗原决定簇降解的几率。而接种量过大，会引起溶氧不足，影响产物合成;过小，发酵周期延长，对豆粕蛋白降解不足，从而影响对致敏原的降解效果。

由图1可知，当接种量低于1×108个时，致敏原降解率随着接种量的增加而逐渐增加。当每10g豆粕接入1×108个米曲霉孢子时，降解率达到最大，为87.35%;此后，接种量继续增加时，降解率则有所下降。因此，选择接种量为每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个。

2.1.2 培养基初始pH对致敏原降解率的影响 料水比为1.0∶1.0(g/mL)，10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个，于30℃霉菌培养箱中发酵96h，考察培养基不同初始pH对米曲霉降解大豆致敏原的影响，结果见图2。

图2 培养基初始pH对米曲霉降解大豆致敏原的影响Fig.2 Effect of initial pH on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

由图2可知，培养基的初始pH对大豆致敏原的降解有显著影响。初始pH过高和过低都会影响米曲霉的生长及所产酶系的活力，不利于大豆致敏原的降解。当初始pH处于6～7这一区间时，致敏原降解率较高;并在pH为6.5时达到最高为89.68%。

2.1.3 料水比对致敏原降解率的影响 当培养基初始pH为6.5时，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个，于30℃霉菌培养箱中发酵96h，考察培养基不同料水比对米曲霉降解大豆致敏原的影响，结果见图3。

图3 料水比对米曲霉降解大豆致敏原的影响Fig.3 Effect of ratio of material to water on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

由图3可知，培养基的料水比对大豆致敏原的降解也极为显著。料水比过低，不利于豆粕中营养物质的溶出，使米曲霉对豆粕的利用率降低;料水比过高，培养基易结块，通气性降低，不利于米曲霉这一好氧菌的生长繁殖。当料水比为1.0∶1.0～1.0∶1.4(g/mL)时，大豆致敏原降解率大大提高，并于1.0∶1.2(g/mL)处达到最高为92.43%。

2.1.4 发酵温度对致敏原降解率的影响 当培养基初始pH为6.5，料水比为1.0∶1.2(g/mL)时，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个，于不同温度的霉菌培养箱中发酵96h，考察不同发酵温度对米曲霉降解大豆致敏原的影响，结果见图4。

图4 发酵温度对米曲霉降解大豆致敏原的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

温度一方面影响菌体自身的生长，影响蛋白酶的产生;另一方面也直接影响蛋白酶的活力。其过高和过低都会对蛋白酶的产生和活力不利。由图4可知，不同发酵温度下，大豆致敏原降解率呈现出明显的变化。28～32℃这一温度范围，是最适合米曲霉生长和酶作用的，从而使大豆致敏原的降解率提高，30℃时可以达到最高为87.83%。

2.1.5 发酵时间对致敏原降解率的影响 当培养基初始pH为6.5，料水比为1.0∶1.2(g/mL)时，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个，于30℃霉菌培养箱中发酵不同时间，考察不同发酵时间对米曲霉降解大豆致敏原的影响，结果见图5。

由图5可知，随着发酵时间的延长，米曲霉及其蛋白酶对大豆致敏原的作用越来越充分，降解率不断提高。发酵 120h，大豆致敏原的降解率达到89.99%，继续延长发酵时间，降解率趋于平缓。

2.2 响应面实验分析及结果

图5 发酵时间对米曲霉降解大豆致敏原的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

2.2.1 实验设计及结果 根据Box－Behnken中心设计原理建立数学模型，以发酵温度、料水比和培养基初始pH为自变量，以致敏原降解率为应变量，设计3因素3水平实验，见表2;实验结果见表3。

表2 响应面分析因素、编码和水平表Table 2 Factors coding and levels in response surface design

根据表3进行米曲霉固态发酵豆粕实验，共实施17次，其中1～12为析因实验，13～17为中心点实验，用来估计实验误差。对表3中Y(致敏原降解率)及3个因素 X1(料水比)、X2(发酵温度)和 X3(培养基初始pH)进行回归分析。各个因素回归拟合后，得致敏原降解率对料水比、温度和pH的二次多项式回归方程:

表3 Box－Behnken实验设计表及结果Table 3 Box－Behnken experimental design and results

2.2.2 响应面分析及最优降解条件的确定 在α=0.05显著水平上，回归方程方差分析显著性检验结果表明(表4)，失拟项p＞0.05，不显著;模型决定系数R2=0.9964，回归模型p＜0.0001，高度显著，说明回归方程的拟合程度较好，实验误差小，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以用于米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的理论预测。

表4 响应面回归模型方差分析结果Table 4 Results of variance analysis for created regression equation

回归模型系数显著性检验结果显示:料水比(X1)、发酵温度(X2)和培养基初始pH(X3)对致敏原降解率有显著的影响。从p值和系数估计大小来看，X3＞X2＞X1，即对抗原性降低的影响因素大小顺序为培养基初始pH＞发酵温度＞料水比。二次项和对抗原性的降低都有显著的影响。交互作用项除X1X2对致敏原降解率显著外，其他X1X3和X2X3对致敏原降解率均不显著。

根据实验因素的显著性分析结果，得到该实验优化后的回归模型为:

根据回归方程利用Design－Expert绘制响应面分析图，如图6所示。

从响应面的最高点可以看出，在所选的范围内存在极值点。同样从各个响应面图中也可以看出，这三个因素之间都存在着一定的交互作用。其中料水比和发酵温度的交互作用最为显著，表现出了与方差分析一致的结果。

2.2.3 验证实验 为了求得米曲霉固态发酵降低大豆抗原蛋白抗原性的最佳条件，对所得的回归拟合方程分别对各自的变量求一阶偏导数，并令其为0，得到三元一次方程组，求解此方程可以得到模型的极值点，即当料水比为1∶1.21、发酵温度为29.8℃、培养基初始pH为6.63时，理论最大降低率为99.15%。

为了检验米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原模型的有效性，进行了验证实验。选取料水比为1∶1.21(g/mL)、发酵温度 29.8℃、培养基初始 pH 为6.63、接种量为每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108个、发酵时间120h，实验重复3次，致敏原降解率分别为99.10%、99.06%、98.91%，平均值为99.02%，与模型的预测值99.15%误差为0.13%，可以看出此模型能够较好地反映出米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的条件。

图6 温度和料水比、初始pH和料水比、初始pH和温度对米曲霉固态发酵降解大豆致敏原影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of effect of tempreture and ratio of material to water，initial pH and ratio of material to water，initial pH and tempreture on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae solid fermentation

3 结论

3.1 根据Box－Behnken中心设计原理，建立米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原模型，以料液比(X1)、发酵温度(X2)、培养基初始pH(X3)为自变量，以致敏原降解率(Y)为应变量，在α=0.05显著水平上，优化回归模型为:自变量影响致敏原降解率大小顺序为:培养基初始 pH＞发酵温度 ＞料水比。

3.2 由响应面数据得出米曲霉固态发酵豆粕降解大豆致敏原的最佳条件为:料水比为1∶1.21(g/mL)、发酵温度29.8℃、培养基初始pH为6.63。在此发酵条件下预测的大豆蛋白致敏原降解率为99.15%，实验平均值为99.02%。

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Optimization of conditions for soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae solid fermentation

HUANG Ying1，QIAN He1，*，WANG He－ya1，ZHANG Wei－guo2，BI Jing－hui1
(1.School of Food Scicence and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

To reduce or even remove the immunoreactivity of solid－state fermented soybean meal by Aspergillus oryzae，the condition of solid －state fermentation was optimized by response surface method.The principal fermentation factors，including ratio of material to water，temperature and medium initial pH were screened from the factors of time，inoculum size，temperature，initial pH and water content by single factor analysis.After that，the optimum fermentation conditions for soybean allergens degradation was comfirmed by Box－Behnken experimental design.And the results showed that under the condition ratio of material to water 1∶1.21(g/mL)，fermentation temperature 29.8℃，pH 6.63，the theoretically lowest allergens degradation rate of 99.15%could be achieved.And the final experimental value of degradation rate was 99.02%，the difference between theoretical value and experimental value was 0.13%，which indicated that the model could be used to predict the experimental value accurately.

soybean allergens;degradation;Aspergillus oryzae;solid－fermentation;response surface method

TS201.3

A

1002－0306(2012)17－0142－05

2012－02－29 *通讯联系人

黄颖(1988－)，女，在读硕士研究生，研究方向:食品安全与质量控制。

“十二五”国家科技支撑计划(2011BAK10B03)。