不同来源蛋白酶水解对大豆分离蛋白分散性及溶解性的影响

王 一，曾茂茂，何志勇，黄小林，陈 洁，*

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122;2.益海－嘉里集团食品技术研究所，河北秦皇岛 066206)

不同来源蛋白酶水解对大豆分离蛋白分散性及溶解性的影响

王 一1，曾茂茂1，何志勇1，黄小林2，陈 洁1，*

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122;2.益海－嘉里集团食品技术研究所，河北秦皇岛 066206)

研究了动物(胰蛋白酶)、植物(木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶)、微生物(碱性蛋白酶和中性蛋白酶)三种来源蛋白酶的低限度水解对大豆分离蛋白(SPI)分散性和溶解性的影响。结果表明，三种来源蛋白酶轻度水解可显著提高SPI的分散性，但却使其溶解性有不同程度的降低。三种来源蛋白酶水解产物的分散度大小依次为:植物来源蛋白酶＞微生物来源蛋白酶＞动物来源蛋白酶，而其溶解性则相反:动物来源蛋白酶＞微生物来源蛋白酶＞植物来源蛋白酶。本文对采用酶解的方法制备高分散性与高溶解性SPI具有一定的参考价值。通过对木瓜蛋白酶水解沉淀物进行分析，可以推测酶解使SPI溶解度显著下降的原因可能是SPI被水解后通过疏水作用力和氢键相互聚集形成了不溶性的沉淀。

大豆分离蛋白，分散性，溶解性，蛋白酶

酶解技术是工业上用于改性大豆分离蛋白(SPI)的常用手段。关于酶解改性SPI的研究很多，如 Qi［1］等采用胰蛋白酶水解 SPI(DH ＞7)，可以提高其在pH4.5和7.0的溶解性;Lamsal［2］等采用菠萝蛋白酶对SPI进行低限度酶解，可以使其溶解度显著提高;高安全［3］等采用中性复合蛋白酶对SPI进行轻度水解，产物溶解度有显著提高;华欲飞［4］等对过渡态大豆蛋白进行酶解，得到一种制备低凝胶性高分散性大豆蛋白的方法;张艳［5］等采用碱性蛋白酶低限度酶解可以改善大豆浓缩蛋白的分散性。这些研究多采用单一来源蛋白酶对大豆蛋白进行水解，研究酶对于产物溶解性或者分散性的影响;而且现有研究结果显示，酶解大豆蛋白通常很难使产物溶解性和分散性同时得到提高。由于不同研究人员采用的底物蛋白大多采用商业SPI，而这些商业化原料由于原料的不同以及加工工艺不同，导致酶解结果很难比较。因此迄今为止，单独从文献角度很难比较不同来源的蛋白酶对大豆蛋白的溶解性和分散性影响效应，也很难直接利用酶解技术来生产同时拥有高分散性和高溶解性的大豆蛋白产品。事实上，国内饮料工业、功能食品工业、冰淇淋以及相关工业对于高分散和高溶解性的SPI的需求很大，而现实中，高分散性的SPI产品通常溶解度不够，而高溶解度的SPI产品通常分散性不够好。基于大豆蛋白工业和研究的现状，采用包括动物(胰蛋白酶)、微生物(碱性蛋白酶与中性蛋白酶)、植物(木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶)三种来源的蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，每种蛋白酶选择3个水解梯度，控制水解度在2%以下，系统地研究了不同来源蛋白酶低限度水解对大豆分离蛋白分散性和溶解性的影响，以期为工业上采用酶解方法生产高分散性和高溶解性大豆分离蛋白提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温脱脂豆粉 秦皇岛金海食品工业有限公司，粉碎后过80目筛，水分8.36%、蛋白质56.91%;胰蛋白酶(8AU/g) 上海林叶生物科技有限公司;碱性蛋白酶(3AU/g) 无锡联合恒洲化工有限公司;木瓜蛋白酶(60万U/g) 广州市众缘生物科技有限公司;中性蛋白酶(10万U/g) 南宁东恒华道生物科技有限责任公司;菠萝蛋白酶(1700GDU/g)

广州市众缘生物科技有限公司;其它化学试剂均为分析纯，国药集团化学技术有限公司。

RO10P磁力搅拌器、20.n机械搅拌器 广州仪科实验仪器有限公司;K10加热制冷循环器 德国HAAKE公司;HH－4数显恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;Avanti J－26 XP高速离心机

美国 BECKMAN公司;DELTA 320型酸度计、JB5374－91电子天平 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;QZ－5高速离心喷雾干燥机 锡山市林洲干燥机厂;AH－BASIC高压均质机 ATS工业系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆分离蛋白的提取 低温脱脂豆粕与水1∶8(m∶v)混合，用3mol/L的NaOH调节pH 为7.8，40℃下搅拌1h，然后10000×g离心10min后取上清液。用3mol/L的盐酸溶液调节上清液pH到4.5，室温搅拌10min，10000×g离心10min后取沉淀。将沉淀加水复溶，配制成6%的大豆分离蛋白储备液。将储备液进行酶解处理后，再用3mol/L的NaOH调节pH到7.0，采用高压均质机20MPa均质三次后，进行喷雾干燥，最后得到SPI。

1.2.2 酶解 将1.2.1中的大豆分离蛋白储备液，用3mol/L的盐酸或3mol/L的NaOH调节pH到7.0，分别加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶五种蛋白酶在不同温度下进行水解(如表1所示)，反应30min后，沸水浴15min灭酶。在反应过程中用pH－stat法［6］测定水解度。每种蛋白酶做3个不同的酶底比(酶的质量与溶液中蛋白质量的比值)，以得到3个不同的水解度。

1.2.3 分散度的测定 分别测定60s分散度和20s分散度两个值，以判断产物在水中的分散能力。

60s分散度:提前准备去离子水30mL于100mL烧杯中，打开搅拌器，保持转速恒定在500r/min，称取0.5g SPI快速倒入烧杯，同时按下秒表，搅拌60s后，关闭搅拌器，迅速将悬浮液倒入60目滤网过滤，测定滤液中蛋白含量。分散度表示为滤液中蛋白质含量与总蛋白质含量的比值［7－8］。滤液中蛋白质含量与总蛋白质含量均采用微量凯氏定氮法［9］测定。

20s分散度:与测定60s分散度的步骤一致，但搅拌时间为20s。

1.2.4 溶解度的测定 在100mL烧杯中倒入30mL去离子水，然后取0.5g SPI，在500r/min下搅拌1h，10000×g离心20min后取上清液，采用微量凯氏定氮法测定上清液中蛋白质含量。溶解度表示为上清液中蛋白质含量与总蛋白质含量的比值［10］。

1.2.5 木瓜蛋白酶水解沉淀物的分析 按照1.2.2中反应条件，用0.1%的木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，将灭酶后的水解液10000×g离心10min，取出沉淀后冷冻干燥，得到蛋白粉，采用微量凯氏定氮法测定蛋白粉的蛋白质含量。参考Chawla［11］的方法并稍作改进。取0.2g蛋白粉，分别溶入4mL不同的缓冲液:S1为20mmol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液;S2为含有1%(w/v)SDS的20mmol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液;S3为含有1%(w/v)SDS和8mol/L尿素的20mmol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液;S4为含有 1%(w/v)SDS、8mol/L尿素和 2%(v/v)β－ME的20 mmol/L pH 8.0 Tris－HCl缓冲液。在40℃水浴锅中静置4h，每隔10min振荡1次，10000×g离心10min后取上清液，加入1mL 50%的TCA溶液，4℃静置18h，使上清液中的蛋白充分沉淀。将沉淀取出，用10%的TCA溶液洗2次，洗完后10000×g离心10min。将最终得到的沉淀溶解于5mL 0.5mol/L的NaOH中，采用双缩脲法［12］测定蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶水解对水解度的影响

胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分别来源于动物、微生物和植物，均是食品工业中常用的蛋白酶。5种蛋白酶采用不同的酶底比对大豆蛋白进行水解，得到不同的水解度，结果如表1所示。过度的水解会使埋藏在长肽链结构内部的疏水性氨基酸大量暴露而导致苦味的产生［5］，通过控制酶底比使水解度的范围在0.5%～1.6%之间，有效地防止了苦味的产生。

2.2 酶解对SPI分散度的影响

采用三种不同来源的蛋白酶对大豆分离蛋白进行不同程度的水解，对得到的蛋白样品60s和20s分散度进行测定，结果如图1所示。植物来源的蛋白酶水解后产物的分散性最高，其中加入0.2%(w/w)和0.5%(w/w)菠萝蛋白酶的样品分散度在20s和60s内均能达到94%以上，加入0.1%(w/w)木瓜蛋白酶的样品20s内分散度则在90%左右;加入微生物来源的碱性蛋白酶和中性蛋白酶的样品，20s和60s的分散度比加植物来源蛋白酶低，但高于动物来源蛋白酶。

2.3 酶解对SPI溶解度的影响

图1 酶解对SPI分散度的影响Fig.1 The influence of enzymes hydrolysis on the dispersibility of SPI

采用三种不同来源的蛋白酶对大豆分离蛋白进行不同程度的水解，对得到的蛋白样品的溶解度进行测定，结果如图2所示。未经处理的大豆蛋白溶解度在90%以上，而经过沸水浴15min热处理后，其溶解度下降到80%以下，这主要是由于100℃的热处理能够使大豆蛋白完全变性，促进蛋白分子相互作用形成不溶性的聚集体［13］。就三种不同来源的蛋白酶而言，动物来源与微生物来源的蛋白酶水解产物的溶解度明显高于植物来源蛋白酶。胰蛋白酶水解产物的溶解度较高，均在80%以上;碱性蛋白酶水解产物的溶解度也在75%以上，而中性蛋白酶，在加酶量为0.05%(w/w)时，溶解度较差，这可能是由于此时蛋白水解程度较低，而加热产生了较多的不溶性聚集［13］，随着加酶量的增加，溶解度逐渐升高，这是由于酶解使肽键断裂形成较多的可溶性多肽和小分子物质，亲水性增加［14］;木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解产物的溶解度均有显著下降。

表1 五种蛋白酶在不同酶底比下的水解度Table 1 Degree of hydrolysis of five enzymes with different enzyme/substrate ratio

2.4 木瓜蛋白酶水解沉淀物的分析

图2 酶解对SPI溶解度的影响Fig.2 The influence of enzymes hydrolysis on the solubility of SPI

Fuke［15］等采用菠萝蛋白酶水解大豆蛋白，发现有较多的不溶性沉淀产生，而沉淀可以完全溶于SDS溶液，所以他推测非共价键特别是疏水作用力促使了沉淀的产生;Nagai［16］等采用枯草菌溶素水解SPI，发现肽链通过疏水作用力结合产生了不溶性沉淀。为探索木瓜蛋白酶水解使SPI溶解度显著下降的原因，对其酶解产生的沉淀进行分析，结果如表2所示。SDS可以破坏蛋白质分子间的疏水作用力［16］，沉淀在SDS缓冲液中的溶解度比在Tris－HCl缓冲液中有所提高，但提高幅度不大，所以单独的疏水作用力并不是沉淀产生的主因;SDS和8mol/L尿素共同作用，可以破坏疏水作用力和氢键［12］，沉淀基本可以完全溶解，这说明疏水作用力和氢键是沉淀产生的主因;含有SDS、尿素和β－巯基乙醇缓冲液，可以打断二硫键和非共价键，沉淀溶解度相对SDS和尿素缓冲液没有明显提高，这说明二硫键并不是沉淀产生的主因。可以推测酶解使SPI溶解度显著下降的原因可能是SPI被水解后通过疏水作用力和氢键相互聚集形成了不溶性的沉淀。

表2 木瓜蛋白酶沉淀在不同缓冲液中的溶解度Table 2 The solubility of SPI aggregate induced by papain hydrolysis with different buffer solution

3 结论

本文研究了动物、植物和微生物三种来源蛋白酶的低限度水解对大豆分离蛋白的分散性和溶解性的影响。结果表明，酶解产物的分散性有显著提高，但是溶解性相对于未加热处理的空白样品均有不同程度的下降，其中植物来源的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解产物的分散性最好，但是溶解性也最差;而动物来源和微生物来源的胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解产物的分散性不如植物来源的蛋白酶，但溶解性显著高于植物来源蛋白酶。通过对木瓜蛋白酶水解沉淀物进行分析，可以推测酶解使SPI溶解度显著下降的原因可能是SPI被水解后通过疏水作用力和氢键相互聚集形成了不溶性的沉淀。

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Effect of hydrolysis by various proteases on the dispersibility and solubility of soy protein isolate

WANG Yi1，ZENG Mao－mao1，HE Zhi－yong1，HUANG Xiao－lin2，CHEN Jie1，*
(1.Institute State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Food Technology Research Institute，Yihai Kerry Oils ＆ Grains Group，Qinhuangdao 066206，China)

Soy protein isolate(SPI)was slightly hydrolyzed by animal protease(pancreatin)，plant proteases(papain＆ bromelin)and microbe－proteases(alcalase ＆ neutral proteinase)respectively，and the effect of hydrolysis on the dispersibility and solubility of SPI was systematically investigated.The results showed that the slight hydrolysis could improve the dispersibility obviously，while decrease the solubility significantly.As for the dispersibility，the three kinds of enzymes could be ranked according to the arrangement from high to low as follow:plant proteases＞microbe－proteases＞animal protease;and as for the solubility，the order was reversed.This study would have some reference value for preparing SPI with high dispersibility and solubility through enzymolysis.The results from the solubility of the insoluble fractions caused by papain hydrolyzation in the different solvents suggested that the hydrophobic area in the soy protein was exposed and promoted the forming of the precipitation.

soy protein isolate;dispersibility;solubility;protease

TS201.1

A

1002－0306(2012)17－0067－04

2012－02－13 *通讯联系人

王一(1987－)，男，硕士，研究方向:食品蛋白质功能。

973计划前期研究专项(2010CB535014);高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20100093120005);中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP21108);益海－嘉里集团食品技术研究所项目。