虾类保藏过程中酚氧化酶酶促黑变作用机理及其抑制方法的研究进展

钱韻芳，谢 晶，吴文惠

（上海水产品加工与保藏工程中心，上海海洋大学食品学院，上海 201306）

虾类保藏过程中酚氧化酶酶促黑变作用机理及其抑制方法的研究进展

钱韻芳，谢 晶*，吴文惠

（上海水产品加工与保藏工程中心，上海海洋大学食品学院，上海 201306）

在虾类贮藏过程中，虾体的黑变严重影响了虾的感官品质，酚氧化酶是催化酪氨酸等色原物质转化为黑色素造成虾体黑变的主要因素。文章综述了国内外酚氧化酶的形成机制研究现状，重点叙述了虾类中酚氧化酶的特性及抑制虾类黑变方法的研究进展，为虾类贮藏保鲜技术的研发与改进提供参考。

虾，黑变，酚氧化酶，机理，防黑变方法

虾是一种肉质鲜美、营养丰富的水产品，深受广大消费者喜爱。然而虾肉中蛋白质含量较高，为微生物的生长繁殖提供了有利条件。因此，虾类在保藏过程中易受微生物的侵染而腐败变质。此外，虾肉中含有酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），在酚氧化酶作用下，虾体中的单酚类化合物氧化生成无色的醌类物质，醌类物质再转化形成黑色聚合物，导致虾体黑变[1]。虾类保藏、销售过程中，虾体黑变是影响虾类外观品质、降低虾类产品商品价值的主要因素。因此，在虾类保藏过程中，除了抑制微生物的生长繁殖，还需采取有效措施防止虾体黑变。了解虾体中酚氧化酶的理化、生物特性及其作用底物和虾类黑变产生机制，可以为探寻有效防止虾类黑变的新途径提供方向。本文综述了虾类酚氧化酶的理化特性、虾体中黑色素形成机理以及防黑变剂和加工方法在防虾体黑变中应用的研究进展，以期为虾类产品保藏技术的开发提供参考。

1 酚氧化酶概述

1.1 酚氧化酶的定义和分类

酚氧化酶是一类广泛存在于甲壳纲动物、果蔬、甚至人体皮肤中的含铜金属酶，同时也是引起甲壳纲动物黑变、果蔬褐变[2-3]以及人体皮肤黑色素沉淀[4]的关键酶。

按照催化底物酚基数量的不同，酚氧化酶可分为单酚氧化酶（Monophenoloxidase，EC 1.14.18.1）、双酚氧化酶（o-diphenoloxidase，EC 1.10.3.1）和漆酶（Laccases，EC 1.10.3.2）[5]。

自然界中存在多种酚氧化酶的同工酶。不同来源的酚氧化酶的名称因作用底物不同而不同，虾类中存在的单酚酶以酪氨酸为主要底物，因此又称为酪氨酸酶（Tyrosinase），双酚酶则又被称为儿茶酚酶（Catecholoxidase）[6]。研究发现，单酚酶同时具有双酚酶活性[7]，因此虾类中的酚氧化酶一般又可称为酪氨酸酶。

1.2 酚氧化酶的结构特点与生化特性

目前，相关科研工作者还没有提取到较纯的酚氧化酶结晶，因此对于酚氧化酶空间结构的研究报道较少。但研究认为酚氧化酶原序列中有两个铜离子结合位点（CuA和CuB），每个位点由3个保守的组氨酸残基和1个铜离子以非共价键连结而成，每两个铜离子能够束缚一个氧分子[8]。当酚氧化酶催化酪氨酸等底物时，底物中的羟基先与该活性中心的原子键合发生作用[9-10]。

酚氧化酶的分子量、最适pH、温度等生化特性与虾的种类有关。表1列出了几种虾类酚氧化酶的分子量大小、最适pH和最适温度。

2 酚氧化酶的生理学作用与激活机制

2.1 酚氧化酶的生理学作用

要寻求能够有效抑制酚氧化酶的方法，首先需要了解酚氧化酶的生理学作用。一般研究认为，酚氧化酶参与了生物体免疫和自身识别系统[18-19]生理作用，包括以下两点：a.参与甲壳动物的外壳硬化；b.修复伤口：虾类等甲壳动物都通过醌类聚合过程生成抗菌化合物来帮助伤口愈合。

2.2 酚氧化酶的激活机制

在节肢动物中，酚氧化酶一般以无活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，pro-PO）的形式存在于血细胞中，与模式识别蛋白、丝氨酸蛋白酶等一同构成了复杂的酚氧化酶原激活系统。研究发现一些外源多糖（微生物细胞壁的主要成分）能够刺激凡纳滨对虾的免疫活性[20]，如酵母多糖（提取自啤酒糖酵母）、葡聚糖（提取自啤酒糖酵母菌）、脂多糖（提取自大肠杆菌O111）、肽聚糖（提取自橙黄微球菌）等。这些多糖类物质能与分子识别蛋白结合，激活酚氧化酶原，其中以肽聚糖的作用最为显著。

血蓝蛋白是一种存在于节肢动物血淋巴中的蓝色、含铜、类似血红蛋白功能的携氧蛋白质，与酚氧化酶（PO）具有较高的同源性，尤其活性位点的相似度很高。有研究表明，在一定条件下，血蓝蛋白在胰蛋白酶水解下能够表现出酚氧化酶的活性[21-22]。因此，血蓝蛋白可能是节肢动物血淋巴的酚氧化酶原[23-24]。

2.3 酚氧化催化黑色素合成路径

酚氧化酶催化酚类化合物生成无色醌类物质，这些醌类物质在非酶促反应下聚合生成黑色素（反应过程见图1），并释放抑菌物质[25-27]。由此可见，酚氧化酶原激活系统是活体虾及其他节肢动物起保护作用的一种免疫反应机制。

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图1 酪氨酸氧化生成黑色素反应路径[9]Fig.1 Formation ofmelanin from tyrosine[9]

3 国内外虾类黑变抑制方法研究进展

3.1 虾类黑变抑制剂

由于苯醌类物质的聚合反应是非酶促反应，因此抑制黑变的研究以抑制前体物质的形成为主。酚氧化酶的抑制方法可分为可逆型抑制和不可逆型抑制两大类，其中可逆型抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。目前，国内外学者主要使用还原剂与抗氧化剂、隔氧成膜剂、金属离子螯合剂以及酚氧化酶结构类似物等防黑变剂来防止或延缓虾体死后黑变。

3.1.1 还原剂与抗氧化剂 二氧化硫产生物（亚硫酸盐、焦性亚硫酸盐等）是使用较为普遍和有效的虾类黑变抑制剂[28]。然而，亚硫酸盐添加到食品中存在严重的安全隐患，低剂量SO2仍可能引起部分人群发生头晕、腹痛、恶心甚至过敏性休克等症状[29-30]。联合国粮农组织和世界卫生组织以及美国、日本、欧盟等国家都严格规定了虾肉中SO2的残留量不得超过0.1mg/g[31]。

抗坏血酸（L-ascorbic acid，Vitam in C）又称维生素C。因其具有较强的还原性和安全性，以及能够防止黑色素沉集而应用在虾类防黑变中。研究表明抗坏血酸能够将苯醌还原成双酚[32]。但也有研究认为在虾类的保藏过程中添加抗坏血酸会使虾体产生特殊的黄色，影响虾的感官品质[33]。异抗坏血酸是抗坏血酸的D型异构体。虽然异抗坏血酸不具备抗坏血酸的生理功能，但是具有和抗坏血酸近似的抗氧化性而被用于防止虾类贮藏过程中产生的黑变。

巯基化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等在生物体中参与氧化还原反应。其中半胱氨酸是人体非必需氨基酸，而谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸3个氨基酸脱水缩合而成，能够抑制日本对虾的黑变[34]。

表1 部分种属虾类酪氨酸酶的生化特性Table 1 Physiochemical properties of polyphenol oxidase from different shrimp species

3.1.2 隔氧成膜剂 可食性涂膜抑制虾类黑变的主要作用原理是阻隔虾类与氧气、水以及空气中微生物的接触[35]，因而对虾体酚类物质的氧化和黑变起到一定的抑制作用[36]。

生物涂膜剂按其成分组成可分为多糖类膜、蛋白类膜、脂质类膜以及复合膜等[37]。其中壳聚糖抑制甲壳动物黑变的效果较明显，研究认为这可能是因为壳聚糖聚合物带有正电荷，能够吸附带负电荷的多酚氧化酶中间产物或底物，并中和了负电荷，从而降低了多酚氧化酶与底物结合的概率[38]，从而抑制了虾类的黑变。

3.1.3 金属离子螯合剂 酚氧化酶的活性中心有两个铜离子，能够结合氧分子，为底物氧化提供氧。如果酚氧化酶的Cu脱离酶活性中心，酚氧化酶则无法结合氧分子催化氧化反应。金属离子螯合剂就是针对这一原理来降低酚氧化酶活性的。目前，常用于防止虾类黑变的金属离子螯合剂有乙二胺四乙酸（EDTA）[39]、植酸[40]、曲酸[41]、鞣酸等。

芳香族羧酸类化合物如苯甲酸、肉桂酸系化合物等，也是一类酚氧化酶的底物类似物。研究发现肉桂酸及其衍生物[44]、阿魏酸[45]、芥子酸[46]、香豆酸[47]、含羞草酸[48]等都有钝化酚氧化酶的作用。

3.1.5 天然混合物抑制剂 近年来随着食品添加剂安全问题越来越受公众关注，源自天然物提取的虾类黑变抑制剂因其安全无害而得到越来越广泛的研发和应用，部分植物来源的酪氨酸酶抑制剂见表2。

研究表明，很多天然提取物对虾体黑变起到了一定的抑制作用，如：绿茶提取物[49]、葡萄籽提取物[50]、银合欢种子提取物[51]等。这些天然提取物的有效成分多为多酚类抗氧化剂，如儿茶素[54-55]、原花青素[56]，以及如槲皮素[57]、芦丁[58]等黄酮类化合物。它们不仅具有很强的还原性，能够清除自由基，而且水溶液稳定性较抗坏血酸好，还有螯合铜离子和抑菌能力[59]，因此对虾类酚氧化酶的抑制类型多为混合型。火焰子提取物中含有的二萜类化合物则不与酚氧化酶的活性中心结合，为非竞争性抑制[52]。然而，由于这些提取物成分过于复杂，天然抗氧化剂的作用机理尚不明确，目前尚难从这些混合物中确定对虾类黑变抑制起主导作用的化合物。

3.2 抑制虾类黑变的处理加工方法

3.2.1 常规处理方法 蒸煮、漂烫是食品中常用的杀菌、灭酶方法[60-61]。经70～90℃热处理能够使酚氧化酶失活，起到较好的虾类黑变抑制效果。但漂烫、蒸煮等热处理会改变产品的颜色、风味及质地，还会使产品丢失维生素、糖及水溶性蛋白质等可溶性营养成分。

低温保藏方式如冷藏、冰温[62]和冻藏[63]都能够降低酚氧化酶的活性，进而延缓虾体的黑变，但不能使酶失活，当恢复到室温时，虾体反而会加速黑变。

酶促反应需要在自由水含量相对较高的环境中进行，因此水分活度AW对于酶促反应体系显得十分重要。一般降低水分活度的方法有：添加持水剂和干燥技术。常见的持水剂有盐、多元醇、糖等，用于降低自由水含量。现在干燥技术中真空冷冻干燥技术被认为是较有效的干燥方法，能在较低的温度下去除水分，且对食品的品质影响较小。但冷冻干燥后的样品更易发生氧化，因此需结合包装技术来提高作用效果。

3.2.2 高压处理 高压处理技术通过改变酶的空间结构能够使酶部分失活或全部失活。研究表明，超高压处理不仅能够降低微生物菌落数，延长新鲜凡纳滨对虾的货架期，还能够降低虾体中酚氧化酶的活性[64-65]。但也有研究发现高压处理促进了虾类黑变[66]，认为这可能与压强和处理时间有关。对比超高压技术对多酚氧化酶提取物和食品介质中酚氧化酶活力的影响研究发现[67]，食品介质可能对酚氧化酶起保护作用，因此在实际应用过程中需要更高的压力和更长的处理时间来钝化食品介质中的酚氧化酶。

3.2.3 高密度二氧化碳处理 高密度二氧化碳是一种通过二氧化碳的分子效应来达到杀菌和钝化酶活效果的新型非热加工技术，能够在低温条件下尽可能地保持食品的天然品质和质量安全[68]。研究表明，高密度二氧化碳处理通过破坏分子间作用力，改变酶的空间结构，降低贮藏期间酚氧化酶的活力，从而抑制了虾的黑变[69]。

3.2.4 高压脉冲电场处理 高压脉冲电场技术利用强电场脉冲来改变反应体系的介电特性，从而降低酶的活性。在20℃下，经过高压脉冲电场（场强13～ 87kV/cm、0.5Hz，处理时间2μs）处理后，酚氧化酶的活力可降低30%～40%[70]。近几年，在果蔬及果蔬汁等产品中应用高压脉冲场技术能够达到钝化酚氧化酶活性和防褐变的效果[71]，但在虾类产品的应用研究较少。

表2 部分植物来源的酪氨酸酶抑制剂Table 2 Tyrosinase inhibitors from different vegetablematerials

3.2.5 气调包装处理 气调包装技术通过调节包装内气体的组分达到降低虾类保藏过程中氧化反应速率的目的。研究认为[72]，低氧气调包装对虾类黑变具有较好的抑制效果，高氧气调包装能够促进虾的黑变。

4 讨论与展望

近几年，国内外学者针对虾类产品防黑变方法的研究进行了许多有益的探讨：a.在防黑变剂的开发方面，研究重点逐渐由单一化合物抑制黑变向复合黑变抑制剂协同作用的方向发生转变；同时，随着人们对食品安全的要求越来越高，化学黑变抑制剂逐渐被天然提取物所替代；b.在加工工艺方面，传统热加工技术已不能满足人们对食品营养、感官品质的要求，加工工艺逐渐向超高压技术、高压脉冲电场技术、气调包装等非热加工处理技术转变。

目前，研究普遍认为虾类黑变的发生主要与酚氧化酶有关，但相关研究者多集中在养殖过程中通过添加免疫激活剂来提高酚氧化酶活性，进而提高虾类养殖过程中免疫力方面的研究，而对于虾类死后保藏过程中酚氧化酶如何被释放、激活以及酶活的抑制机制是如何失效的研究报道较少。因此，结合虾类保藏特点和目前虾类黑变抑制技术的研究现状，提出虾类黑变抑制有以下研究方向：

a.应用栅栏技术提高虾类黑变抑制效果。复合多种黑变抑制剂或结合加工工艺，能够提高单一黑变抑制剂或加工工艺抑制黑变的效果，并降低虾类黑变抑制剂的使用剂量或加工处理强度，以满足食品安全的要求。

b.深入研究活虾酚氧化酶的调控机制，借鉴活虾自身的酚氧化酶活性抑制机理，从酶促反应的前馈和反馈控制方面进行研究，模拟活虾酚氧化酶的调控机制来人为干预虾类死后酚氧化酶的活性调控，从而获得虾类黑变抑制的有效方法。

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Research progress inmelanosismechanism of shrim p products induced by phenoloxiade and the use of anti-melanosis techniques during preservation

QIAN Yun-fang，XIE Jing*，WUW en-hui
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，College of Food Science and Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

Melanosis in shrim p reduces the customers’accep tability d rastically，leading to the decreasing of market values and considerab le financial loss，which is triggered by a kind of enzymes called phenoloxidase. Phenoloxidase oxid izes tyrosine to quinine lead ing to b lack high molecular weight p igment.Studies on the mechanism s of phenoloxidase activation system and phenoloxidase inhibitory methods domestically and ab road were reviewed，in order to p rovide information for further study and development in shrimp p reservation techniques.

shrim p；melanosis；phenoloxidase；mechanism；anti-melanosis methods

TS254.1

A

1002-0306（2012）22-0400-06

2012－08－03 *通讯联系人

钱韻芳（1985-），女，博士研究生，研究方向：食品保鲜。

“十二五”国家支撑计划项目（2012BAD29B06）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20113104110005）；上海市科委工程中心建设（11DZ2280300）。