高效液相色谱-二极管阵列检测法测定原料乳中的舒巴坦

刘珊珊，单 艺，满朝新，谢鲲昊，卢 雁，胡惠秩，阎天文，姜毓君，，*

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030;2.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150086)

高效液相色谱-二极管阵列检测法测定原料乳中的舒巴坦

刘珊珊1，单 艺2，满朝新2，谢鲲昊1，卢 雁2，胡惠秩1，阎天文1，姜毓君1，2，*

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030;2.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150086)

建立了利用高效液相色谱-二极管阵列法（high-performance liquid chromatography-photodiode array，HPLC-PDA)测定原料乳中舒巴坦含量的方法。采用C18色谱柱，以5.44g/L磷酸二氢钾溶液（pH5.0)-乙腈（95∶5)为流动相，流速为lmL/min，检测波长220nm，柱温30℃。样品经乙腈提取、乙酸锌沉淀蛋白，HPLC-PDA检测。舒巴坦浓度在10～200μg/mL范围内，线性良好（R2=0.9998)，添加回收率为98.82%～101.42%，检出限为0.25mg/kg，定量限为0.75mg/kg。该方法操作简单，结果准确、可靠，适用于原料乳中舒巴坦的快速检测。

舒巴坦，高效液相色谱-二极管阵列检测法，含量测定，原料乳

舒巴坦（sulbactam，简称SBT)，又称青霉烷砜酸，属于青霉烷砜类半合成β-内酸胺酶抑制剂，是一种竞争性、不可逆的β-内酰胺酶抑制剂药物[1]。临床数据表明，过量使用舒巴坦可引起患者转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶升高，并可能引起皮疹，药热等过敏反应。研究报道显示，现有检测舒巴坦的方法包括分光光度方法[2]、毛细管电泳方法[3]、气-质联用方法[4]、液-质联用法[5]、高效液相方法[6-10]。分光光度方法的检测限较低;毛细管电泳方法检测基质范围有限;气-质联用方法中，样品前处理需要进行衍生化反应，操作复杂，回收率低;液-质联用法灵敏度高，抗干扰能力强，但是设备昂贵。高效液相法操作简便、成本低廉，便于推广。自2009年春季起，一些违法份子在含有β-内酰胺酶的原料乳中添加舒巴坦，使该酶失去活性，导致β-内酰胺酶阳性奶不能被检测出来，为乳品安全埋下隐患，严重威胁消费者的身体健康，降低了人民群众对食品安全尤其是乳品安全的信任度，因此建立原料乳中舒巴坦的检测方法已经迫在眉睫，然而，国家尚未出台舒巴坦的相关检测标准。本研究工作建立了一种高效简便的检测原料乳中舒巴坦的高效液相色谱-二极管阵列检测方法，适用于检测机构、科研院所、工厂等单位进行乳中舒巴坦的初步筛选。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

舒巴坦标准品 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度＞99%;乙腈 色谱纯，Sigma公司;原料乳 黑龙江省哈尔滨市周边奶站;磷酸、磷酸二氢钾等其他试剂 国产分析纯。

2695高效液相色谱仪、2998二极管阵列检测器、Empower色谱工作站 美国Waters;BS210S型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;MILLIPORE超纯水仪 美国密理博;色谱柱：Hypersil ODS C-18（250mm×4.6mm，5μm) Thenno Hypersil公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 采用Hypersil ODS2 C-18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm);以5.44g/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（95∶5)为流动相，缓冲液现用现配制，再经0.45μm微孔滤膜过滤。流速1mL/min;检测波长为220nm;柱温30℃;进样体积10μL。

1.2.2 溶液制备

1.2.2.1 缓冲溶液 乙酸锌溶液（200g/L)：称取20g乙酸锌于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸溶液（1mol/L)：称取6.28mL磷酸溶液于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸盐缓冲液（5.44g/L)：称取5.4g磷酸二氢钾，加入800mL水溶解，磷酸调pH至5.0，加水定容至1000mL。

1.2.2.2 储备液 精密称取100mg舒巴坦标准品，置于100mL容量瓶中，以磷酸盐缓冲液溶解稀释至刻度，摇匀，作为储备液。标准工作液按实验需要用流动相稀释相应浓度。

1.2.3 样品处理 准确称取原料乳10g于三角瓶中，加入35mL乙腈，混匀，超声提取30min。冷却至室温，加入200g/L乙酸锌2.0mL，乙腈定容至50mL，涡旋0.5min，10000r/min离心5min，收集上清液10mL，10000r/min再离心5min，将上清液经0.45μm滤膜过滤后，即可进行HPLC-PDA测定。

2 结果与分析

2.1 样品处理过程的确定

本实验采用有机沉淀体系（乙腈、甲醇)与无机沉淀体系相结合的方法沉淀样品中的蛋白质。由于原料乳中的蛋白质含量较高，单纯使用乙腈作为沉淀剂，无法沉淀完全，残留的蛋白质会堵塞色谱柱，影响实验的进行，因此采用乙腈初沉后，加入乙酸锌再次沉淀原料乳中蛋白质的两段式沉淀法。当采用甲醇作沉淀试剂时，在稀释10倍下沉淀蛋白效果良好，但峰形较差，出现肩峰;最终采用乙腈作沉淀试剂，在稀释5倍下沉淀蛋白效果良好，回收率理想，同时改善了峰形。

2.2 色谱条件的确定

参照美国药典26版和日本药典14版，检测舒巴坦的波长分别为230、220nm。本实验将舒巴坦标准溶液在190～400nm波长范围内进行扫描，见图1。根据二极管阵列检测器获得的光谱图可知，舒巴坦在194nm处有最大吸收，以此最大吸收波长为检测波长，等浓度下对舒巴坦进行HPLC测定，发现此时舒巴坦的峰值最高，峰面积稳定。采用194nm检测波长，相同条件下对乳品中舒巴坦进行测定，发现虽然舒巴坦被定性保留，但由于乳基质成分较多且复杂，前处理过程不可能把诸如短钛物质都沉淀完全，因此会有其他物质的干扰，使舒巴坦峰的基线分离不完全，峰面积不准确。基于以上原因，本实验最后选定末端吸收220nm作为检测波长。

图1 舒巴坦标准品全波长扫描曲线Fig.1 The full scan curve of sulbactam standard solution

舒巴坦是极性物质，易溶于水中，在甲醇中略溶[11]。因此本实验选用Hypersil ODS C-18（250mm× 4.6mm，5μm)色谱柱，舒巴坦得到较好的保留。参考2005版中国药典[12]，确定流动相为5.44g/L磷酸二氢钾溶液-乙腈。舒巴坦易被强酸、强碱物质降解[13]，本实验发现当缓冲盐溶液pH＜3.0时，溶质分子通常会降解成其他物质，导致峰裂解;当缓冲盐溶液pH＞6.0时，舒巴坦几乎全被降解成6-氨基青霉烷酸，导致主成分损失;当缓冲盐溶液pH4.0～5.0时，色谱峰窄而尖，舒巴坦性质稳定，没有出现降解现象，因此，最终选择pH5.0作为流动相的酸碱度，舒巴坦保留良好，且达到基线分离。

从图2中可以看出，舒巴坦标准品的保留时间为5.027min，原料乳样品中舒巴坦的保留时间为5.054min，与标准品中舒巴坦的保留时间基本一致。

图2 舒巴坦标准品色谱图与原料乳中舒巴坦色谱图Fig.2 Chromatograms of sulbactam standard solution and sulbactam in milk spiked

2.3 工作曲线

在上述色谱条件下，配制舒巴坦标准溶液10、50、100、150、200μg/mL每个浓度样品平行3次实验。以峰面积（Y)为纵坐标，浓度（X)为横坐标，得回归方程y=10196x+70083，相关系数（R2)为0.9998，说明在10～200μg/mL范围内线性关系良好，见图3。该方法定量限为0.75mg/kg（按信噪比S/N＞10计算)，检出限为0.25mg/kg（按信噪比S/N＞3计算)。

图3 舒巴坦标准曲线Fig.3 The standard curve of sulbactam

2.4 精密度与回收率

采用标准添加法，取空白原料乳，分别加入舒巴坦标准溶液5、50、100μg/mL，进行3个浓度水平的加标回收实验，各浓度做3次平行，进行HPLC-PAD测定，该方法的回收率在98.82%～101.42%、相对标准偏差在2.31%～2.76%之间，见表1。

表1 原料乳中添加舒巴坦的回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of sulbactam in raw milk

3 结论

本研究采用反相C18色谱柱，以磷酸盐缓冲溶液（pH5.0)-乙腈作为流动相，样品经乙腈溶液提取，乙酸锌沉淀蛋白，得到舒巴坦在原料乳中的保留时间为5.054min。该方法快速可靠，经大量实验结果验证，适合原料乳中舒巴坦的检测要求，填补了国内空白。建立了HPLC-PDA方法检测乳中舒巴坦含量。采用二极管阵列检测器对样品峰进行全波长扫描，避免其他物质的干扰，定性更可靠。样品前处理操作简便、无需净化，不但大大缩短了样品前处理时间，同时也减少样品在处理过程中的损失，使得分析物质的回收率大大提高。因此采用HPLC-PDA法检测原料乳中舒巴坦的含量具有更普遍的应用性。

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Determination of sulbactam in raw milk by the high-performance liquid chromatography-photodiode array detection

LIU Shan-shan1，SHAN Yi2，MAN Chao-xin2，XIE Kun-hao1，LU Yan2，HU Hui-zhi1，YAN Tian-wen1，JIANG Yu-jun1，2，*
（1.Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Department of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

To develop a method for the determination of sulbactam in raw milk using high performance liquid chromatography-photodiode array detector（HPLC-PDA).C18column was used，the mobile phase consisted of 5.44g/L potassium dihydrogen phosphate solution（pH5.0)-acetonitrile（95∶5)at the flow rate of 1mL/min，the detection wavelength was 220nm.The column temperature was 30℃.Acetonitrile was used for extraction，zinc acetate was used for protein precipitation，the filtered fluid was determined by high performance liquid chromatography-photodiode array detector.The linear calibration curve was obtained in the concentration range of 1～200μg/mL（R2=0.9998)with the lower limit of detection of 0.25mg/kg and lower limit quantification of 0.75mg/kg.The average recovery of sulbactam was 98.82%～101.42%.The method was simple，accurate，reliable and could be used for rapid determination of sulbactam in raw milk.

sulbactam;high-performance liquid chromatography-photodiode array（HPLC-PDA)detection;content measured;raw milk

TS252.7

A

1002-0306（2012)16-0064-03

2012－01－06 *通讯联系人

刘珊珊（1982-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。

国家科技支撑计划课题（2012BAK17B04);国家科技支撑计划课题（2009BADB9B06)。