紫杉烷微生物转化研究进展

蒋彭成，陈碧峰，郑 水，唐 亮*

1长沙医学院 基础医学系，长沙410000;2香港中文大学生物医学系，香港100871;3云南大学 微生物研究所，昆明650091

微生物转化(microbial transformation)是利用微生物代谢过程中产生的酶对外源底物进行结构修饰和改造的催化反应，故又称之为微生物酶法转化。至目前为止，已经从微生物中发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶。近十几年来，学者们已经利用从微生物中获得的脂肪酶和蛋白酶对多种天然多羟基化合物包括皂草苷类、黄酮苷类、生物碱类、甾醇类、倍半萜(烯)化合物、熊果苷和槐糖脂等进行了酶催化下的选择性酯化反应。

紫杉醇是天然植物类抗肿瘤新药，是用于临床效果最好、毒副作用最低的抗癌药物之一［1］。目前，人们可能获得紫杉醇的方法主要是直接从红豆杉中提取、化学全合成以及化学半合成［2］。近年来，利用微生物将紫杉醇副产物(紫杉烷)转变成紫杉醇的技术逐渐兴起，极大的提高了红豆杉的利用率，节约了大量紫杉醇资源植物。本文就现阶段紫杉烷微生物转化研究进行综述。

1 BMS研究进展

目前对紫杉烷类化合物的微生物转化研究尚处于起步阶段，目的性较弱的非定向转化研究比较多。较为系统的工作是由美国施贵宝公司药物研究协会(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)的R.N.Patel和R.L.Hanson领导的研究小组进行的，经过长达十几年的探索，已取得一定进展。

BMS 由 R.N.Patel 和 R.L.Hanson［3］领导的小组最成功的研究是利用微生物转化进行紫杉醇的半合成。研究小组首先从白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus)SC13911、藤黄类诺卡氏菌(Nocardioides luteus)SC13912、莫拉氏菌(Moraxella sp.)三种微生物中分离得到C-13侧链水解酶、C-10脱乙酰酶、C-7木糖甙酶三种酶。分别将分离自Taxus hicksii幼苗中的数种紫杉烷(BaccatinⅢ、10-deacetyl Taxol、7-xylosyl Taxol 、7-xyloxyl-10-deacetyl Taxol、Cephalomannie等)的7、10及13位进行水解，得到较多单一的10-deacetyl BaccatinⅢ作为紫杉醇(或多烯紫杉醇)合成的前体。再将 Nocardioidesluteus SC13912所产的C-10脱乙酰酶固定化，以乙酸乙烯酯为酰基供体，把10-DAB乙酰化生成巴卡亭Ⅲ，其转化率最高可达 51%［4，5］。

2 其它研究概况

其它对微生物转化紫杉烷类化合物的研究主要涉及水解、酯化、羟基化、脱氢、差向异构化等反应类型。

2.1 水解反应

2.1.1 7-木糖基水解

近年来，R.N.Patel和R.L.Hanson领导的小组还进行了其它方面的研究。他们发现Nocardioides luteus SC13912除具有C-10脱乙酰酶活性外，同时还具有C-6羟化酶活性。施贵宝公司还发现了一株莫拉氏菌(Morexella sp)能产生7-(-木糖甙酶，该酶能将10-脱乙酰-7木糖紫杉烷中的木糖基酶解掉。Wang［6］发现除施宝贵公司报道的莫拉氏菌(Morexella sp)外还有诸如链霉菌属(Streptomyces)，如马特链霉菌(Streptomyces matensis)，异硫链霉菌(Streptomyces althioticus，Streptomyces griseorubens)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)如Paenibacillus pabuli，无色杆菌属(Achromobacter)，如 Achromobacter spanius，Achromobacter piechaudii.假单胞菌属(Pseudomonas)，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)，Pseudomonas asplenii等，都能产生分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶(如图1)。

图1 7-木糖基紫杉醇木糖基反应Fig.1 C-7 xylosidase of 7-xylosyl paclitaxel

2.1.2 乙酰基水解

除施贵宝(BMS)公司R.N.Patel和R.L.Hanson等筛选到的藤黄类诺卡氏菌(Nocardioides luteus)SC13912、红球菌(Rhodococcus sp．)ATCC202191和ATCC202192具有脱乙酰基作用外。张君增［7］等从云南红豆杉树皮内分离出的微生物中发现3株具有转化天然紫杉烷类化合物的能力，其中 MicrospHaeropsis onychiuri和毛霉(Mucor sp.)都可水解10-脱乙酰-7-表紫杉醇的13位侧链并可使7位羟基差向异构化，而链格孢菌(Alternaria alternata)则在1β-羟基巴卡亭Ⅰ的不同位置进行水解。贾红婷［8］以一株未鉴定的真菌“方21”对云南红豆杉甲素(Yunnanxane)C-10位上的乙酰基进行特异性水解，生成10-deacetyl Yunnanxane，转化产率在30%以上。李松［9］等，也发现一株可专一性水解巴卡亭Ⅲ的C-10位乙酰基成团泛菌Pamoea agglomerctn。

2.2 酰化反应

图2 10-DAB C-10位酰基化Fig.2 C-10 acetylation of 10-DAB

紫杉烷的 C13位侧链的酰化和C5，C7，C10等位长的疏水侧链都能发生酰化反应。酰基水解酶在特定的条件下也是酰化酶。施贵宝公司将腾黄类诺卡氏菌产生的脱C-10乙酰酶固定化以乙烯基乙酸酯为供体将 10-DAB 转化成 Baccatin-Ⅲ［4］(如图2)。

2.3 羟基化反应

Hu［10］等利用刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)对sinenxan A进行选择性脱乙酰和羟基化反应，当pH值不同时，产物的种类和量都会有很大变化，证明了高pH条件下更易进行水解反应。Shen［11］等用黑曲霉(Aspergillus niger)对 Baccatin Ⅵ和1β-Hydroxy BaccatinⅠ进行转化，得到四个新紫杉烷衍生物。

2.4 脱氢与差向化反应

A.Arnone［12］等用新月弯孢菌(Curvularia lunata)和毛栓菌(Trametes hirsute)对10-DAB进行转化，分别使10-DAB的C-13位的羟基发生脱氢、C-7位差向化和C-10位脱氢等反应，得到7-epi-10-DAB、7-epi-10-oxo-10-DAB等数种新产物。占纪勋［13］等对32株微生物(包括真菌和细菌)对紫杉醇进行微生物转化的筛选，经TLC检测发现稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)AS1.1584、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)AS1.860、普通变形菌(Proteus vulgaris)AS1.1208和极小短小杆菌(Curtobacterium pusillum)AS1.1905均具有转化紫杉醇的能力。

3 展望

虽然目前大部分微生物转化工作还停留在初级的新反应筛选和发现上，但微生物转化的作用不可忽视。今后，在继续研究发现新的转化反应的同时，要加大力度对重要的反应进行深入研究，通过优化反应条件、诱变菌株、提纯重要的酶、克隆酶的基因等手段，并结合固定化技术、基因重组技术，不断提高转化效率和延长菌株或酶的使用时间，充分发挥微生物转化的长处，为新药研究提供强有力的支持。相信，微生物转化研究将在紫杉醇类药物合成和结构修饰中继续发挥重要作用。

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