响应面法优化红花籽粕5-羟色胺衍生物提取工艺

李文聪，杨仁明，强 伟，索有瑞，丁晨旭*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001;2中国科学院研究生院，北京 100049

红花(Carthamus tinctorius L)菊科属植物，是一种药、染料、油、饲料兼用的经济作物［1］。红花籽，中药习称“白平子”，是红花(Carthamus tinctorius L)的种子［1］。红花籽粕是红花籽提取油后的废弃物，国内多用作廉价的肥料和饲料，对其中的化学成分研究较少。近年来，国外对红花籽粕中的一些微量成分进行了研究，发现红花籽粕中的5-羟色胺衍生物具有极强的抗氧化性和清除自由基活性［2］，可以调节人体内免疫反应，抑制肿瘤［3］、保护人体中的NK细胞免受程序性死亡［4］、强烈抑制黑色素生成等活性［5］。红花籽粕中的N-阿魏酰5-羟色胺和N-(p-香豆酰)5-羟色胺具有保护心脏的功能，可以促进心肌运动，预防心肌机能发生障碍［6］。有的研究还表明，N-(p-香豆酰)5-羟色胺可以促进成纤维细胞增殖［7］，并且将会是一种很好的抗炎药物［8］，对促进人类的健康有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花籽粕购自新疆;5-羟色胺硫酸肌酐标准品(纯度99%);甲醇、乙醇和正己烷(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

优普UPT系列超纯水器，成都超纯科技有限公司;ALC-110.4型电子天平，德国Acculab公司;HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;EYELA N-1100型旋蒸蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;UV-759紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 5-羟色胺衍生物的提取方法

准确称取过筛后的红花籽粕5.00 g，加入不同的有机溶剂回流提取，提取液减压抽滤，用旋转蒸发仪蒸干，再用体积分数80%甲醇溶解，用正己烷萃取，取80%甲醇相，用旋转蒸发仪蒸发，用甲醇溶解测定5-羟色胺衍生物含量。

具体的操作流程:红花籽粕(原料)→过筛→红花籽粕粉末→回流提取→减压抽滤→滤液→蒸干→80%甲醇溶解→正己烷萃取→分液(80%甲醇相)→蒸干→甲醇溶解→5-羟色胺衍生物含量测定。

1.4 标准曲线的制作和5-羟色胺衍生物含量测定［8］

精确称取5-羟色胺硫酸肌酐标准品0.1 g，0.1 mol/L盐酸定容至100 mL。精密吸取1 g/L的5-羟色胺硫酸肌酐溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容。用0.1 mol/L盐酸做空白，310 nm波长处测5个样品的吸光度(A)，以5-羟色胺衍生物浓度(C，g/L)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法计算得到回归方程 A=3.1802C+0.0222(R2=0.999)。

5-羟色胺衍生物提取得率/%=(红花籽粕5-羟色胺衍生物质量/红花籽粕质量)×100%

1.5 单因素实验设计

1.5.1 提取溶剂对提取得率的影响

准确称取5.00 g粉碎度为32目的红花籽粕粉末5份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，液料比20∶1(mL/g)，分别以70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂，80℃条件下回流提取2 h。

1.5.2 原料粒度对提取得率的影响

选取12、20、32、40和60目的红花籽粕进行研究。其他的回流提取条件:无水乙醇为提取溶剂、回流温度为80℃、回流提取时间为2 h、液料比为20∶1，测定提取得率。

1.5.3 提取时间对提取得率的影响

控制回流条件:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度32目、液料比为20∶1、提取温度为80℃。提取时间选取0.5、1、1.5、2、2.5、3，考察其对提取得率的影响。

1.5.4 提取温度对提取得率的影响

控制回流条件:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度32目、液料比为20∶1、提取时间为2 h。提取温度选取50、60、70、80和90℃，考察其对提取得率的影响。

1.5.5 液料比对提取得率的影响

控制回流条件:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度32目、回流温度80℃、提取时间2h。液料比选取5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，考察其对提取得率的影响。

1.6 响应面法优化设计

本试验采用Design expert8.0软件中的Box-Behnken中心组合试验设计响应面试验。根据单因素试验结果，选取提取时间、提取温度和液料比3个因素作为试验因素，以5-羟色胺衍生物提取得率为响应值设计试验，试验因素及水平见表1。

表1 红花籽粕5-羟色胺衍生物提取响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of experimental response surface methodology

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取溶剂对5-羟色胺衍生物提取得率的影响

图1 不同提取溶剂对5-羟色胺衍生物提取得率的影响Fig.1 Effects of extraction solvent type on 5-hydroxytryptamine derivatives

从图1可以看出，不同提取溶剂对红花籽粕中5-羟色胺衍生物提取得率影响较大。乙酸乙酯和甲醇的提取效果最好，无水乙醇的提取效果差一些。但无水乙醇安全、无毒，而且价格便宜、来源广泛，适合工业化操作。因此，选取无水乙醇作为提取溶剂。

2.1.2 原料粒度对5-羟色胺衍生物提取得率的影响

图2 原料粒度对5-羟色胺衍生物提取得率的影响Fig.2 Effects of size of material on 5-hydroxytryptamine derivatives

图5 液料比对5-羟色胺衍生物提取得率的影响Fig.5 Effects of liquid-to-solid ratio on 5-hydroxytryptamine derivatives

从图2可以看出，原料粒度小于32目时，原料粒度对提取效果的影响非常大。原料的粒度大于32目时，原料粒度的升高对提取得率没有影响。考虑到原料进行长时间的粉碎会增加了操作成本，而且从图1看，高于32目的粒度是没必要的，确定32目为最佳原料粒度。

2.1.3 提取时间对5-羟色胺衍生物提取得率的影响

由图3可知，提取时间对提取率有较大影响，随着提取时间的增加，5-羟色胺衍生物提取得率呈增长的趋势，在2.0 h之后增长趋势减缓，考虑到提取周期，选取1.5、2、2.5 h 进行中心组合试验。

2.1.4 提取温度对5-羟色胺衍生物提取得率的影响

由图4可知，5-羟色胺衍生物提取得率随温度升高而增加，在80℃之后，增长趋势减缓，故选取提取70、80、90℃进行中心组合试验。

2.1.5 液料比对5-羟色胺衍生物提取得率的影响

由图5可知，随着液料比增加，5-羟色胺衍生物提取得率有所增加，在料液比15∶1之后，得率随着用液量增加趋势明显减缓，考虑节约成本，选取液料比10∶1、15∶1、20∶1 进行中心组合试验。

2.2 响应面法优化红花籽粕5-羟色胺衍生物提取工艺

2.2.1 模型方差分析

对红花籽粕5-羟色胺衍生物提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表2。

表2 5-羟色胺衍生物提取工艺条件的优化试验设计及结果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0软件对各因素回归拟合，得回归方程:5-羟色胺衍生物提取得率=0.53+0.04X1+0.035X2+0.031X3-0.7344 × 10-3X1X2-4.403 ×10-3X1X3-0.013X2X3-9.187 ×10-3♂ -0. 015♂

表3 方差分析结果Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3可知，回归模型(P＜0.0001)极显著，相关系数 R2=0.9874，失拟项(P=0.5137 ＞0.05)影响不显著，表明该模型拟合度很好，因此，可以用该回归模型对实验参数进行分析。回归模型方差分析的结果表明:X1、X2、X3、X2X3、X3X3(P ＜0.01)为极显著项;X1X2、X1X1(P ＜0.05)为显著项;其余项不显著。通过F值得出:提取时间(X1)对5-羟色胺衍生物提取得率影响最显著，其次是提取温度(X2)，液料比(X3)的影响相对较少。

2.2.2 响应面分析

提取时间(X1)、提取温度(X2)、液料比(X3)3个因素之间的交互作用对5-羟色胺衍生物提取得率的影响如图6所示。其中，提取温度与液料比(X2X3)之间的交互作用极显著，随着温度和液料比的增加，5-羟色胺衍生物提取得率达到最大;提取时间与提取温度(X1X2)之间的交互作用显著;提取时间与液料比(X1X3)之间的交互作用不显著。

依据所得模型，可预测稳定状态下红花籽粕5-羟色胺衍生物的提取最优工艺:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度为32目、提取时间为2.4 h、提取温度为89℃、液料比为19∶1。红花籽粕5-羟色胺衍生物的提取得率可达0.34%。

2.3 工艺验证

为了验证该响应面分析法结果的可靠性，按上述最佳工艺(提取时间为2.4 h、提取温度89℃、液料比19∶1)进行3次平行实验，实际测得5-羟色胺衍生物提取得率的平均值为0.33%。表明预测值(0.34%)与实际值(0.33%)之间具有很好的拟合性，从而进一步证明优化结果的可靠性。

3 结论

本文在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法对红花籽粕5-羟色胺衍生物提取工艺进行了优化，得出最佳提取工艺:提取溶剂为无水乙醇、原料粒度为32目、提取时间为2.4 h、提取温度为89℃、液料比为19∶1。回归分析和验证试验结果表明，采用响应面法优化红花籽粕5-羟色胺衍生物的提取工艺条件，得到的提取工艺流程具有实际应用价值。

图4 因素间交互作用的响应曲面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots between factors

1 Guo ML(郭美丽)，Zhang HM(张汉明)，Zhang MY(张美玉).Herbological Study of"Honghua.J Chin Med Mater(中药材)，1996，19:202-203.

2 Kumarasamy Y，et al.Biological activity of serotonin conjugates from the seeds of Centaurea nigra.Fitoterapia，2003，74:609-612.

3 Arze E，et al.Serotonin inhibition of tumor necrosis factor-alpha synthesis by human monocytes.Life Sci，1991，48:2557-2562.

4 Betten A，et al.Serotonin protects NK cells against oxidatively induced functional inhibition and apoptosi.Leukoc Biol，2001，70:65-72.

5 Jung SR，et al.Inhibitory effects of active compounds isolated from safflower(Carthamus tinctorius L.)seeds for melanogenesis.Biol Pharm Bull，2004，27:1976-1978.

6 Hotta Y，et al.Protective effects of antioxidative serotonin derivatives isolated from safflower against post ischemic myocardial dysfunction.Molecular and Cellular Biochemistry，2002，238:151-162.

7 Takii T，et al.Multiple mechanisms involved in the inhibition of proinflammatory cytokine production from human monocytes by N-(p-coumaroyl)serotonin and its derivatives.Intl.ImrMunophar macol，2003，(3):273-277.

8 Kang GH，Chang EJ，Choi SW.Antioxidative activity of phenolic conrpounds in roasted safflower(Carthamus tinctorius L)seeds.Food Sci Nutr，1999，4:221-225.