落叶松树皮原花青素提取工艺的研究

崔晓霞，张小丽，罗书勤，张力平

北京林业大学材料科学与技术学院，北京，100083

原花青素是1967年美国人最早从葡萄皮和葡萄籽中提取分离出4种多酚化合物，得到的多酚化合物在酸性介质中加热均可产生花青素(cyanidins)，故将这类多酚化合物命名为原花青素［1］(Proanthocyanidins，PC)。有人将其归为生物类黄酮，也有人将其归为缩合鞣质。原花色素是植物体内生成的复杂多酚类物质，原花青素为其中分布最广、数量最多的一种［2］。原花青素广泛分布于植物界，如葡萄、苹果等水果中和山楂的皮、核、梗以及黑荆树、松树皮、银杏、野生刺葵、番荔枝等植物中，也存在于某些饮料(茶叶、啤酒)、蔬菜和粮食中，与人类生活和健康密切相关［3-5］。原花青素具有多种化学与生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏和保护心血管和预防高血压、抗肿瘤和抗辐射等功能，在食品、保健品、化妆品及医药等领域具有广泛的应用前景［6］。

落叶松属松科落叶松属植物，分布于我国东北，为大、小兴安岭海拔300～1200 m地带的主要林木，俄罗斯(远东地区)也有分布。树皮中含有丰富的原花青素类化合物［7-9］，是一种极具利用价值的绿色资源。为了充分利用落叶松树皮资源，确定其最佳的活性物质原花青素的提取工艺，本文以落叶松树皮为原料，采用超声提取法对原花青素的提取工艺进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

原料:落叶松树皮由内蒙古拓孚林化有限责任公司提供。

试剂:原花青素标准品，含量≥95%，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司;色谱甲醇，J.T.Baker(USA);无水乙醇、盐酸、正丁醇、十二水合硫酸铁铵，均为分析纯，北京化工厂。

仪器设备:旋转蒸发器，RE52CS-1型，上海亚荣生化仪器厂;紫外可见分光光度计，UV-1801型，北京瑞利分析仪器公司;数控超声波清洗器，KQ5200DB型，昆山市超声仪器有限公司;全自动精密分析天平，TG328A型，上海精密科学仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9030A型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 落叶松树皮中原花青素的提取方法

将落叶松树皮粉碎至30～40目，准确称取20 g于500 mL锥形瓶中，加入200 mL一定浓度的乙醇溶液浸泡24 h，在一定的料液比、乙醇浓度和提取温度下超声提取一段时间，取出真空抽滤，滤液经减压浓缩后置于30℃鼓风干燥箱内干燥，得到原花青素粗品。研究料液比、乙醇浓度、提取温度、超声时间对原花青素提取率的影响。并以乙醇浓度、超声时间、料液比、提取温度设计L9(34)正交试验(见表1)，探讨最佳工艺条件。为了提高试验精度，每组实验均重复两次。

表1 正交实验的因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 标准溶液

精确称取原花青素标准品，用甲醇溶解定容，配制成0.00、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的标准系列溶液，分别取1 mL各种浓度的标准溶液于10 mL的具塞试管中，依次加入0.2 mL 2%的盐酸-硫酸铁铵溶液、6 mL正丁醇－盐酸溶液，混合均匀后在95℃的热水中加热反应40 min，取出后立即冷却至室温。以甲醇溶液为空白，用紫外分光光度计在546 nm处测定其吸光度值，绘制原花青素标准溶液的标准曲线图，见图1。对标准曲线样点进行线性拟合，得到标准曲线回归方程:y=2.636x-0.0026 ，R2=0.9992，其中 x 为浓度(mg/mL)，y 为吸光度，R2为相关性因数。

图1 Bate-Smith法标准曲线Fig.1 the standard curve of the Bate-Smith analysis method

1.2.3 原花青素含量测定

准确称取10 mg原花青素用适量甲醇溶解，定容至50 mL。取上述溶液1 mL于10 mL具塞试管中，依次加入0.2 mL 2%的盐酸-硫酸铁铵溶液、6 mL正丁醇－盐酸溶液，混合均匀后于95℃的热水中反应40 min，取出后立即冷却至室温。以甲醇溶液作为空白，用紫外分光光度计在546 nm处测得其吸光度值。并根据回归方程计算待测液中的原花青素的含量，其公式为:

式中:Ym为原花青素的得率，%;m1为原花青素粗提物的质量，g;m2为落叶松树皮的质量，g;w为落叶松树皮的含水率，%;X为被测样品原花青素的含量，%;A为吸光度值;T为原花青素的提取率，%。

2 结果与讨论

2.1 反应条件对原花青素提取率的影响

2.1.1 料液比对原花青素提取率的影响

图2 料液比对超声提取的影响Fig.2 Effects of solvent to material ratio on ultrasonic extraction

由图2可知，随着料液比的增大，原花青素的提取率呈先上升后下降的趋势。提取溶剂的用量越大，其提取效率则越好。但是，在一定量的提取溶剂中，原花青素已经全部溶出，再增加提取溶剂的用量并不能提高提取率，这是因为溶剂过多时，超声波的能量对沉淀底层的落叶松树皮颗粒的空化效应和机械效应的强度减弱，影响超声提取的效果。因此选择最佳料液比为1∶15。

2.1.2 乙醇浓度对原花青素提取率的影响

图3 乙醇浓度对超声提取的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on ultrasonic extraction

由图3可知，随着乙醇浓度的提高，原花青素的提取率增大，当乙醇浓度为50%时提取率达到最大值。水是典型的强极性溶剂，介电常数很大，而乙醇的极性相对要弱一些，调节乙醇和水的配比能够调节萃取溶剂的极性。原花青素为极性化合物，根据相似相溶原理，选择适宜的乙醇和水的配比可以提高原花青素的提取率和纯度。

图4 提取温度对超声提取的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on ultrasonic extraction

2.1.3 提取温度对原花青素提取率的影响由

图4可知，随着温度的升高，原花青素的提取率呈先上升后下降的趋势，当温度为35℃时，提取率达到最大值。温度升高会提高物质的溶出，但如果进一步升高，则会导致原花青素氧化分解，杂质溶出量增加，影响提取效率。因此，选择35℃为落叶松树皮原花青素的最佳提取温度。

2.1.4 超声时间对原花青素提取率的影响

图5 超声时间对超声提取的影响Fig.5 Effects of extraction time on ultrasonic extraction

由图5可知，超声时间较短时，原花青素不易溶出，随着超声时间的延长原花青素的提取率也会随之提高，超声时间为30 min时提取率达到最高。但是随着超声时间的增加，落叶松树皮内外组分浓度逐渐趋于平衡，物质难以溶出，而且提取时间的延长还会导致其受热时间过长而变性，从而导致提取率下降，因此确定最佳超声波作用时间为30 min。

2.2 正交实验

按1.2.1所述L9(34)正交实验设计因素水平安排，考察松树皮中原花青素的提取效果。实验结果及分析见表2。

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，乙醇浓度、超声时间、料液比和提取温度等四个因素对原花青素的提取效果均有显著影响。对落叶松树皮中原花青素提取率影响的主次顺序为:D＞B＞A＞C，即提取温度＞提取时间＞乙醇浓度＞料液比，且A1B1C1D3为最佳方案，即乙醇浓度为50%，超声提取时间为0.5 h，料液比取1∶15，提取温度为35℃。

2.3 落叶松树皮原花青素含量的测定

按照1.2.3的方法测定落叶松树皮原花青素粗品的含量，其紫外分析结果如图6所示。

图6 落叶松树皮超声提取物的紫外光谱图Fig.6 UV absorption spectrum of larch bark OPC by ultraphonic

根据文献报道［10］，正丁醇-盐酸法测定原花青素的原理是基于其花色素反应，即原花青素在热酸作用下能产生红色物质，从而可用分光光度法进行测定。对于单体原花青素黄烷-3，4-二醇来说，C-4位具有极强的亲电性，其醇羟基与C-5，C-7上的酚羟基组成一个苄醇系统，使得4位碳易于形成正碳离子。在强酸作用下，正碳离子失去质子，氧化生成花色素。对于聚合原花青素，其单元间连接键易在酸作用下被打开，下部单元生成黄烷-3-醇，上部单元生成花色素。落叶松树皮原花青素粗品的紫外分析结果表明，落叶松树皮的提取物在正丁醇-盐酸体系中热后成为红色，即发生了花色素反应，而且在546nm处出现明显的紫外吸收峰，由此可以初步判断出落叶松树皮中含有原花青素。

3 结论

本文研究了料液比、乙醇浓度、提取温度、超声时间对原花青素提取率的影响，并利用正交实验对落叶松树皮原花青素的提取工艺进行了研究，通过结果分析及实际生产考虑确定的最佳提取工艺为:乙醇浓度为50%，超声提取时间为0.5 h，料液比取1∶15，提取温度为35℃，其提取率为17.52%。紫外分析表明，落叶松树皮提取物在热酸作用下在546 nm左右具有特征吸收峰，即本实验提取出的落叶松树皮提取物中含有原花青素成分。

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