酱油渣中蛋白的乳化特性研究

张兴茂，吴 晖，赖富饶

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

酱油渣中蛋白的乳化特性研究

张兴茂，吴 晖*，赖富饶

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

对比分析了酱油渣中蛋白（SRP)、糖基化大豆分离蛋白（GSP)和大豆分离蛋白（SPI)的ξ-电位、疏水性以及乳化活性和乳化稳定性。发现SRP的总糖和蛋白含量比为1∶1.4，其中含有大量的糖蛋白;SRP疏水性是SPI的2.5倍。SRP等电点接近pH=3.5，在酸性环境下溶解性较好。在酸性、高盐环境下SRP乳化能力高于GSP和SPI，在pH=5时，SRP的乳化活性（EAI)是SPI的8.1倍，在NaCl浓度为0.3mol/L时，SRP的EAI是SPI的1.77倍。

酱油渣，蛋白，乳化性，疏水性

酱油生产过程中，在多种微生物以及生化作用下，发生多种复杂的生化反应，主要包括多糖水解、蛋白水解和美拉德反应。经过美拉德反应后的糖基化蛋白等电点降低[1]，且具有良好的抗热聚性[2]、强凝胶强度[3]、乳化性，尤其在酸性环境下乳化性明显高于未糖基化蛋白。目前，还未见对酱油渣蛋白的相关研究。我国是酱油生产大国，产生的大量废渣由于水分含量高，营养丰富，极易腐败变质，主要作为饲料处理[4]。酱油渣中除了膳食纤维、食盐外，还含有大量的蛋白质[5]，这些蛋白具有特定的活性，因此分析酱油渣中蛋白为充分利用酱油渣资源提供理论依据。本实验主要从ξ-电位、乳化性和疏水性方面研究酱油渣蛋白的特性，为进一步应用酱油渣提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白 实验室自备;酱油渣 海天调味食品股份有限公司;茶油 广东新大地生物科技股份有限公司;氢氧化钠、盐酸、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰乙酸等 均为分析纯;1-苯胺基萘-8-磺酸（ANS) BiO basic inc.（加拿大);十二烷基硫酸钠（SDS) 广东光华化学厂有限公司。

CR22GⅡ高速冷冻离心机 Hitachi Koki公司;NaNo-Zs马尔文纳米粒度分布仪 Marlvern公司（英国);Varioskan Flash spectral scan multimode plate reader

Thermo Electron Co.，（USA);高速分散匀浆机 上海标本模型厂;XSP-3CA1单目生物显微镜 上海标仪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酱油渣中蛋白提取工艺 参考杨涛[6]、孙炜炜等人[7]碱溶酸沉法提取分离蛋白的方法，酱油渣经50℃蒸馏水清洗3次，抽滤后的沉淀用pH=9.0的NaOH溶液提取蛋白（50℃，1h，2次)，离心得到上清液，上清液调节至pH=4左右，离心得到蛋白沉淀，将沉淀复溶（pH=7.5)，透析，冷冻干燥即得酱油渣蛋白。

1.2.2 大豆分离蛋白糖基化 参考Diftis N[8]，胡坤[9]等人的方法，大豆分离蛋白与麦芽糊精（质量比1∶1)溶解于去离子水中，冷冻干燥后粉碎，置于含饱和KBr溶液的反应器中，60℃下反应9d。反应物冷冻干燥得到糖基化大豆分离蛋白。

1.2.3 酱油渣及酱油渣蛋白常规指标的测定 蛋白质含量的测定：GB/T 5009.5-2003[10]。水分含量的测定：GB/T 5009.3-2003[11]。灰分的测定：GB/T 5009.4-2003[12]。糖含量测定：苯酚-硫酸法[13]。

1.2.4 糖蛋白验证 参考孙宇婧等人[14]的方法，通过Sevag法去除样品中的游离蛋白，经过多次Sevag试剂处理，每次处理后用苯酚-硫酸法测溶液中总糖含量，用考马斯亮蓝法[15]测定溶液中蛋白质含量。

1.2.5 ξ-电位测定 采用马尔文纳米粒度分布仪测定SRP、GSP和SPI的ξ-电位。将蛋白质溶解于蒸馏水中，水化30min后，0.45μm微滤膜过滤，用马尔文纳米粒度分布仪测ξ-电位，pH范围是pH=2.7至5.7，测定温度为25℃，重复测定3次以上，取平均值。

1.2.6 表面疏水性测定 参考Kato A[16]和张春岭[17]等人的ANS荧光探针法。将蛋白质样品溶于0.01mol/L磷酸缓冲液中，配成5mg/mL的溶液，在均质机上均质1min，然后离心（3500×g，10min)，取上清液，用考马斯亮蓝法测定溶液中蛋白的浓度，然后将上清液稀释成不同的浓度梯度后，取不同浓度的样品溶液3mL，分别加入15μL浓度为8mmol/L的ANS溶液（0.02mol/L，pH7.2磷酸缓冲液)振荡，静置10min，然后测其荧光强度（FI)。在本实验中激发波长370nm，发射波长470nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。

1.2.7 不同pH环境下蛋白质乳化活性及乳化稳定性测定 蛋白样品溶解于不同pH的磷酸盐缓冲溶液（0.02mol/L)中，蛋白浓度为1mg/mL，取10mL样品加入3mL植物油于室温下10000r/min均质1min以形成乳化液，均质后立即从乳化液底部吸取100μL，用10mL 0.1%的SDS稀释后在500nm条件下测定吸光值A0，以此吸光值表示乳化活性[18]。将上述乳状液静置10min后从底部取100μL乳浊液，迅速分散于10mL 0.1%的SDS溶液中，于500nm波长下测吸光度A10。乳化稳定性计算公式：ES（%)=A10/A0×100%。ES表示乳浊液制备后放置10min的稳定性。

1）前期准备工作：教师根据授课的内容布置的医学专题，课前3天发给学生，要求学生自由分组，对所提问题充分预习教材、查找相关资料；2）具体实施：①30分钟学生们针对理论课布置的医学专题进行讨论，提出问题及可能的解决方案；②病房对患者进行生产实践，30分钟询问病史、查体；③用约1小时时间共同参加讨论；④课后就提出的问题，自由分组结合，通过期刊、数据库资源查找循证医学证据 ，评价胸痛的临床诊断思路；急性心肌梗死从发病机制、病理表现及治疗措施等任一环节的基本理论及最新的研究进展，并结合患者的具体情况制定最佳临床方案并列出所读的参考文献及出处；⑤由组长将每位同学的诊疗方案返回带教老师。

1.2.8 不同盐浓度环境下蛋白质乳化活性及乳化稳定性测定 蛋白质溶解于不同NaCl浓度的磷酸盐缓冲液（pH=7，0.02mol/L)中，按照1.2.7的方法测定蛋白质乳化活性和乳化稳定性。

1.2.9 乳化液微观结构观察 乳化液按照1.2.7所述方法进行制备，取1滴乳化液置于载玻片上，盖上盖玻片，在显微成像系统下进行观察，放大倍数为320。

2 结果与分析

2.1 酱油渣及酱油渣中蛋白常规指标分析

表1 酱油渣及SRP主要成分含量（g/100g)Table 1 The ingredient in soy sauce residue and SRP（g/100g)

由表1可知，酱油渣经水洗，去掉盐等可溶性物质后，蛋白质含量为7.26g/100g，占干物质的28.25%，总糖含量5.42g/100g，占干物质的21.09%;分离得到的SRP中含有大量的总糖，含量为37.13g/100g，总糖含量与蛋白质含量比为1∶1.4。

2.2 糖蛋白验证

图1 Sevag试剂处理次数与总糖、蛋白含量的关系Fig.1 The relation of times treated by Sevag reagent and

由图1可知，用Sevag试剂处理样品溶液前6次，蛋白质和总糖含量下降都不明显，分别下降了9.78%和15.60%，说明游离蛋白含量较少;而处理第7次和第8次时，蛋白质含量和总糖含量都迅速下降，分别下降了60.66%和68.09%，可能由于样品中蛋白质含量较高，经过Sevag试剂多次处理后，蛋白质强变性而大量沉淀，而结合的糖基也随之沉淀。可以推测，SRP含有大量的糖蛋白。

2.3 ξ-电位

SPI、GSP和SRP在不同pH条件下的ξ-电位测定结果如表2。

表2SPI、GSP和SRP的ξ-电位Table 2 The ξ-potential of SPI，GSP and SRP

酱油发酵和糖基化过程中，蛋白质一些带电荷基团与多糖结合，失去解离能力，另一方面蛋白空间结构发生变化可能使其他带电荷基团暴露，从而改变整个蛋白的电荷特征[19]。根据表2可知，SRP等电点接近于pH=3.5，糖基化后GSP等电点下降，接近pH= 4.0，与SPI的等电点接近于pH=4.8。SRP等电点比SPI低，在酸性环境下SRP有更好的溶解性，结果与El fadil等人[20]的结果相符。

2.4 表面疏水性分析

由于ANS荧光探针法能与蛋白质中芳香族氨基酸特异结合，荧光强度与分子表面芳香族氨基酸含量成正相关关系;所以此法应用于测定蛋白质表面芳香族氨基酸作用下的疏水性[21]。根据图2可知，SPI、GSP和SRP荧光强度对蛋白浓度作图的斜率分别是3.99、6.75和10.15，参考Wang[22]等人的方法，用斜率表示疏水性。方差分析表明SPI、GSP和SRP表面疏水性存在显著性差异，SRP的疏水性是SPI疏水性的2.55倍。说明SRP较SPI分子表面含有大量的芳香族氨基酸，疏水性较强。由于芳香族氨基酸的亲油性，使酱油渣蛋白的乳化性得到提高。

图2SPI、GSP和SRP的表面疏水性Fig.2 The surface hydrophobicity of SPI，GSP and SRP

2.5 不同pH环境下蛋白质乳化活性及乳化稳定性

图3 不同pH下SPI、GSP和SRP乳化活性Fig.3 The EAI of SPI，GSP and SRP in different pH

如图3可知，在pH=5至9的条件下，随着pH上升，三种蛋白质的乳化能力都提高，并且SRP的乳化活性都明显高于SPI和GSP，在pH=5时，接近SPI的等电点，乳化能力最低，此时SRP与SPI乳化能力相差最大，SRP的乳化活性是SPI的8.1倍。而在pH=4.0时，接近SRP的等电点，SRP沉淀，乳化活性低于SPI。如图4可知，在pH=6，7时，SRP的乳化稳定性高于SPI、GSP。在pH=4，5时，由于GSP的乳化活性低，乳状液静置10min前、后吸光度值都较低，两者数值上相差不大，所以根据公式[ES（%)=A10/A0×100%]计算出的乳化稳定性高于SRP，同理在pH=5时，SPI表现出的乳化稳定性高于SRP。

图4 不同pH下SPI、GSP和SRP乳化稳定性Fig.4 The ES of SPI，GSP and SRP in different pH

2.6 不同盐浓度下蛋白质的乳化活性和乳化稳定性

图5 不同盐浓度下SPI、GSP和SRP的乳化活性Fig.5 The EAI of SPI，GSP and SRP in different salinity

盐离子能改变蛋白质分子得失质子的平衡[23]，从而影响蛋白的乳化活性及乳化稳定性。如图5，随着NaCl浓度的增加，SPI和GSP的乳化活性都急剧下降，在0.3mol/L的NaCl浓度时降至较低值，之后下降趋势缓慢，幅度较小;0.3mol/L NaCl浓度对应的SRP乳化活性是SPI的1.77倍。如图6可知，随着盐浓度增加，三种蛋白质的乳化稳定性都下降明显，SPI与GSP在NaCl浓度为0.2mol/L时降至较低值，当NaCl浓度达到0.4mol/L时SRP乳化稳定性下降到最低，但总体乳化稳定性仍明显高于SPI和GSP。

2.7 乳化液微观观察结果

图7 SRP和SPI的乳化液乳滴微观结构Fig.7 The microstructure of emulsion droplet with SRP and SPI

由图7可知，在pH=7、6环境下SRP的乳化液滴分散均匀，液滴较小;pH=6时，SPI乳化体系中出现明显的大液滴，说明SPI乳化活性下降;如e和f所示，pH=5时，SRP乳化体系中乳滴有所增大，SRP乳化活性降低，但SPI已经出现沉淀物质、失去乳化能力。在酸性环境下SRP乳化活性明显高于SPI，乳滴微观结构观察结果与乳化活性实验结果一致。

3 结论

酱油渣中含有7.26g/100g的蛋白质，5.42g/100g的总糖;SRP中总糖含量与蛋白含量比为1∶1.4，根据Sevag法可以推测SRP中含有大量糖蛋白。SRP的表面含有较多的芳香族氨基酸，表面疏水性是SPI的2.55倍。

SRP等电点在pH=3.5左右，GSP等电点在pH=4左右，SPI等电点在pH=4.8左右;在酸性环境下SRP保持良好的溶解性，乳化活性明显高于其他两种蛋白。

在高盐浓度环境下，GSP和SPI乳化活性以及乳化稳定性明显下降;SRP乳化活性下降缓慢，乳化稳定性下降显著。在乳化体系静置10min后，SRP乳化活性依旧高于GSP和SPI。

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Study on the analysis of emulsifying properties of protein in soy sauce residue

ZHANG Xing-mao，WU Hui*，LAI Fu-rao
（College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The ξ-potential，hydrophobicity，emulsifying activity（EAI)and emulsion stability（ES)of soy sauce residue protein（SRP)，glycosylated soy protein isolate（GSP)and soy protein isolate（SPI)were analyzed. Results suggested that the fraction ratio of sugar and protein in SRP was 1∶1.4 and there was huge mount of glycoprotein in it.The hydrophobicity of SRP was 2.5 times of that of SPI.The isoelectric point of SRP was approximately pH=3.5 and the solubility of SRP under acidic environment was reasonable.SRP’s emulsibility was much higher than that of GSP and SPI in acid and high salt environment.SRP had EAI values up to 8.1 and 1.77 times of SPI under pH 5 and 0.3mol/L NaCl environment，respectively.

soy sauce residue;protein;emulsifying properties;hydrophobicity

TS201.7

A

1002-0306（2012)07-0067-04

2011－06－24 *通讯联系人

张兴茂（1987-)，男，在读硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。

教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目（NCET-06-0746)。