固定化葡萄糖异构酶活化条件对其酶活的影响

胡 弢，周雪艳，赵国群

(河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018)

固定化葡萄糖异构酶活化条件对其酶活的影响

胡 弢，周雪艳，赵国群

(河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018)

固定化葡萄糖异构酶在使用前需先进行活化，从而使酶发挥其最佳催化功效。本文从糖液浓度、温度、pH、活化时间和金属离子五个方面研究了活化条件对GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖异构酶酶活的影响。该酶的最适活化条件为:葡萄糖液浓度60%、温度55℃、pH 7.5、时间4h。经此条件活化之后，其酶活达815U/g，与常规活化条件相比，酶活提高了40%以上。固定化葡萄糖异构酶活化时不宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+。

活化，果葡糖浆，固定化葡萄糖异构酶

果葡糖浆是一种新发展起来的淀粉糖品，广泛应用于食品工业，尤其是软饮料工业［1－2］。工业上一般采用玉米淀粉为原料，先经过双酶液化和糖化，转化为葡萄糖溶液，然后采用固定化葡萄糖异构酶进行异构化反应，得到果糖和葡萄糖的混合液即果葡糖浆［3］。因此，葡萄糖异构酶是果葡糖浆生产中的一个关键酶，其酶活的高低直接影响着生产效率和生产成本。为了方便储运及较高的稳定性，固定化葡萄糖异构酶的商品形态多为干燥的颗粒，其中只含极少量的水，因此酶颗粒使用前需进行活化(水化)。活化过程就是用底物(葡萄糖浆)来使酶颗粒吸收水分，从而使酶发挥其催化功效［4］。如果活化条件不适当，固定化葡萄糖异构酶就不能获得理想的酶活，从而影响其催化效率。关于葡萄糖异构酶的固定化方法、稳定性和反应条件对其催化性能影响的研究很多，但是关于固定化葡萄糖异构酶使用前的活化研究却少有报道［5－7］。本文对以果葡糖浆生产上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖异构酶的最佳活化条件进行了研究，以期提高活化后的酶活，进而提高葡萄糖异构为果糖的生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖异构酶(简称异构酶) 无锡杰能科生物制品有限公司，粒径300～1200，浅棕黄色;葡萄糖 分析纯，石家庄华营葡萄糖有限公司;果糖 分析纯，天津市永大化学试剂开发中心;MgSO4分析纯，天津市大茂化学试剂厂;ZnSO4分析纯，天津市化学试剂三厂;CoSO4、MnSO4分析纯，天津市博迪化工有限公司。

Ajilent 1100高效液相色谱仪 配示差折光检测器和Rev.A.10.02色谱工作站，美国安捷伦。

1.2 实验方法

1.2.1 活化时间对异构酶酶活的影响 配制浓度为30%的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L的NaOH溶液调pH到7.5。取5支试管，每支试管中加入0.2g异构酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后将试管置于40℃水浴锅中分别浸泡(活化)0、1、2、3、4、5h。倾倒、沥干糖液，测定酶活。

1.2.2 糖液浓度对异构酶酶活的影响 分别配制浓度为30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液调pH到7.5。取5支试管，每支试管中加入0.2g异构酶和5mL所配制的葡萄糖溶液。将试管置于40℃水浴锅中活化4h。倾倒、沥干糖液。

1.2.3 温度对异构酶酶活的影响 配制浓度为60% (W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液调pH到7.5。取4支试管，每支试管中加入0.2g异构酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，分别在25、35、45、55、70℃水浴锅中活化4h。

1.2.4 糖液pH对异构酶酶活的影响 分别将60%葡萄糖溶液的pH调整为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。取5支试管，每支试管中加入0.2g异构酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后将试管置于55℃水浴锅中活化4h。

1.2.5 金属离子对异构酶酶活的影响 配制浓度为60%的糖液400mL，用NaOH溶液调pH到7.5，并均分到 4个烧杯中，然后分别添加 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4配制成1.0mmol/L的葡萄糖液。取4支试管，每支试管中加入0.2g异构酶和5mL配制好的含金属离子葡萄糖溶液，然后将试管置于55℃水浴锅中活化4h。

1.3 分析方法

1.3.1 固定化葡萄糖异构酶酶活的测定 本实验按照GB8274－87(固定化葡萄糖异构酶制剂)中所示的方法测定葡萄糖异构酶的酶活。0.2g固定化葡萄糖异构酶在葡萄糖溶液活化之后，倾倒、沥干糖液，加磷酸缓冲液1.5mL，硫酸镁溶液0.5mL，葡萄糖溶液1.5mL，再加去离子水调整至总体积5mL，70℃反应1h，加高氯酸溶液5mL终止反应，用高效液相法测定其中果糖含量。异构酶的酶活力定义为:在pH为7.5，温度为70℃的条件下，每小时生成1mg果糖所需的最小酶量为1个酶活力单位。

异构酶酶活(U/g)=果糖浓度(mg/mL)×稀释倍数×10/酶质量

1.3.2 果糖含量的测定 本实验采用高效液相色谱法来测定果葡糖浆中果糖的含量。其检测条件为: Waters Sugar－Park色谱柱，示差折光检测器，流速0.5mL/min，温度70℃，流动相纯水，流速0.5mL/min，进样量20.0μL。

2 结果与讨论

2.1 活化时间的影响

将固定化葡萄糖异构酶浸泡在30%葡萄糖溶液(40℃)中进行活化，控制不同的活化时间，然后测定其酶活，结果见图1。从图1中发现，活化1h的异构酶酶活明显低于未经活化的异构酶。随着活化时间的延长，异构酶酶活逐渐提高。当活化时间为4h时，其酶活达到最高为720.3U/g。然而，当活化时间延长到5h时，酶活又显著下降，低于未经活化的异构酶。为了方便储存和运输，异构酶固定化后生产为干态。在干燥过程中，异构酶因失水而发生空间构象的变化，进而影响其酶活。在葡萄糖溶液中进行活化时，异构酶的空间构象趋于恢复原态，其恢复的程度可能与活化时间、活化温度、糖液浓度等有关，也可能与固定化时使用的固定载体有关。可能正是这些影响因素不恰当组合，使得活化后的异构酶空间构象恢复的不理想或最佳空间构象未能长时间保持，从而活化时间过短或过长均造成异构酶酶活降低。

图1 活化时间对异构酶酶活的影响Fig.1 Effect of activation time on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.2 糖液浓度的影响

在果葡糖浆的生产上，通常使用40%～50%的葡萄糖浆(纯度93%)进行活化［4］。考虑到果葡糖浆的实际生产，本实验采用的活化介质为葡萄糖溶液。将固定化葡萄糖异构酶分别在30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液中40℃下活化4h，实验结果见图2。如图2所示，糖液浓度对异构酶酶活有显著的影响。当糖液浓度为60%时，异构酶酶活最高，达到了811U/g，同40%葡萄糖溶液相比，异构酶酶活提高了233U/g。糖液浓度的高低影响着其中的水分活度。糖液浓度越低，糖液中的水分活度越大，异构酶颗粒越容易吸收水分，复水速度越快。从实验结果分析，过快或过慢的复水速度都不利于活化后获得最高酶活。

图2 糖液浓度对异构酶酶活的影响Fig.2 Effect of syrup concentration on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.3 活化温度的影响

异构酶固定化后，耐温性增强，但当温度超过70℃时仍容易变性失活，从而导致酶活降低。因此，生产商建议的活化温度为25～55℃。如图3所示，在25～55℃范围内，随着糖液活化温度的升高，异构酶酶活逐渐增加。当活化温度为55℃时，活化后的酶活最高，达815U/g，同25℃相比，异构酶酶活增加了251.8U/g。当活化温度超过55℃时，异构酶酶活明显下降。由实验结果可知，在实际生产中选择适宜的活化温度对提高异构酶酶活很重要。

图3 活化温度对异构酶酶活的影响Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.4 糖液pH对异构酶酶活的影响

根据来源不同，异构酶的最适pH有所差异，一般糖异构酶的最适pH在6.5～8.5。由图4可见，当糖液pH从6.5升高到7.5时，异构酶酶活逐渐升高。pH 7.5与pH 8.0的酶活基本相同。但在碱性条件下高温(60℃)会使葡萄糖糖浆的颜色加深，所以糖液pH选定7.5为宜。实验结果还表明，异构酶活化的最适pH与进行酶催化的最适pH基本一致。

图4 pH对异构酶酶活的影响Fig.4 Effect of pH on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.5 金属离子对酶活的影响

葡萄糖异构酶是金属酶。在葡萄糖异构化为果糖时，Mg2+、Co2+、Mn2+等对该酶有激活作用，而Ca2+、Hg2+、Cu2+等则起抑制作用［8－9］。为了考察金属离子在异构酶活化时的影响，在60%葡萄糖溶液中分别添加 1.0mmol/L的 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4，55℃下活化4h，结果见图5。由图5可见，同未加任何金属离子的对照相比，异构酶活化时添加Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但没有使酶活升高，反而明显降低了酶活。这说明Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+在活化时均起抑制作用。造成这种现象的原因可能是活化时添加的金属离子干扰了异构酶水化过程中最佳空间构象的恢复，从而造成酶活的降低。

图5 金属离子对异构酶酶活的影响Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

3 结论

本实验以果葡糖浆生产上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖异构酶为研究对象，研究了活化条件对其酶活的影响。实验结果表明活化条件对固定化葡萄糖异构酶酶活有非常显著的影响。GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖异构酶的适宜活化条件为:葡萄糖液浓度60%、温度55℃、pH7.5、时间 4h。经此条件活化之后，其酶活达815U/g，同酶生产商推荐活化条件(葡萄糖液浓度40%、温度40℃、pH7.5、时间7h)相比，异构酶酶活提高了40%以上。此外，在固定化葡萄糖异构酶活化时不适宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+等金属离子。

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Influence of activation conditions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

HU Tao，ZHOU Xue－yan，ZHAO Guo－qun
(College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

Activation was need before immobilized glucose isomerase was used in order to make it have the best catalytic ability.The influences of activation conditions on the enzyme activity of GENSWEETTMIGI－SA immobilized glucose isomerase were studied including concentration of glucose syrup，temperature，pH，activation time and metal ions.The optimal activation condition was as follows:Glucose syrup 60%，temperature 55℃，pH 7.5 and activation time 4h.Under this condition，the enzyme activity of immobilized glucose isomerase was 815U/g，which was 40%higher than one under normal activation condition.Mg2+，Co2+，Mn2+and Zn2+were not necessary to be added into glucose syrup when immobilized glucose isomerase was activated.

activation;high fructose syrup;immobilized glucose isomerase

TS201.3

A

1002－0306(2012)10－0223－03

2011－11－07

胡弢(1977－)，男，讲师，博士，研究方向:生物催化技术。