结核杆菌19 ku脂蛋白的表达与纯化

胡 松，张莹莹，秦 琴，赵佩莹，毕建平，黄继良

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

据WHO的报告，全球现有结核病人约2000万，结核病在世界很多地区流行，结核再次成为严重的世界性疾病［1］。结核分枝杆菌（Mycobacte⁃rium tuberculosis）属胞内寄生菌，在感染早期被巨噬细胞吞噬后，可抵抗宿主的杀伤，维持结核杆菌胞内繁殖和扩散，结核病的发生与发展与结核杆菌在巨噬细胞中的生存有直接关系。近来，结核分枝杆菌细胞壁上的一种相对分子质量19 ku（p19）的脂蛋白被证实可以对巨噬细胞中IFN-γ依赖的抗原递呈途径干扰［2］，p19是一种主要存在于结核杆菌细胞壁上的糖基化脂蛋白，被认为是细菌毒力因子之一［3］，具有一定的免疫原性。该蛋白可诱导机体产生特异性抗体，激发T细胞介导的免疫反应，其编码基因存在于结核杆菌和卡介苗中，全长为479 bp。

本实验拟通过克隆卡介苗中的脂蛋白19 ku编码基因，构建原核表达质粒pET28a-p19，在大肠埃希菌BL21中诱导表达，经镍柱纯化后得到约为19 ku的融合蛋白，为实验后期进一步研究做前期准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 大肠埃希菌DH5α与大肠埃希菌BL21为本室保存，卡介苗购自武汉市疾控中心。原核表达质粒pET28a由江汉大学罗峰博士惠赠。

1.1.2 试剂 限制性内切酶BamHI、HindIII、T4DNA连接酶、蛋白分子量标准购自Fermentas公司，玻璃奶胶回收试剂盒购自博大泰克公司，蛋白质纯化层析树脂（Ni-NTA）购自GE公司，2X Taq Mix、DNA Marker DL6000、小量质粒提取试剂盒、改良罗氏培养基购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.3 引物合成 引物由上海生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 卡介苗基因组模板制备 卡介苗（No.2006120601）接种于改良罗氏培养基斜面上，37℃恒温箱中培养4周，肉眼可观察到淡黄色菜花状菌落。挑取单个菜花状菌落加入200 μL超纯水水浴煮沸10 min，使其充分裂解，获得卡介苗基因组模板。

1.2.2 PCR引物的设计 根据Gen Bank中报道的p19基因序列结合所用载体设计引物，引物序列：上游：CGC GGA TCC GTG AAG CGT GGA CTG A；下游：CCC AAG CTT TTA GGA ACA GGT CAC CTC GAT T，其中在5’端分别引入BamHI、HindIII酶切位点。

1.2.3 目的基因的获得 在50 μL反应体系中，上、下游引物各4 μL，终浓度为0.4 μmol/L，卡介苗基因组模板 2 μL，2X Taq Mix 25 μL，超纯水15 μL。置于PCR仪中，扩增条件：95℃ 5 min—94℃ 45 s—55℃ 45 s—72℃ 45 s，共30个循环—72℃10 min。在1%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增片段，玻璃奶快速纯化回收试剂盒进行胶回收。

1.2.4 表达载体的构建 用BamHI、HindIII双酶切PCR回收产物和pET28a质粒，经琼脂糖凝胶电泳后玻璃奶快速纯化回收试剂盒回收目的条带，将p19目的条带与pET28a质粒回收产物通过T4DNA连接，16℃过夜后，转化宿主菌大肠埃希菌BL21（DE3），筛选阳性重组子，用碱裂解法快速小量提取质粒进行酶切鉴定，正确的细菌命名为pET28a-p19。

1.2.5 p19序列分析 pET28a-p19大肠埃希菌工程菌中p19目的基因序列的测定由武汉华大基因公司完成，结果使用BLAST软件比对。

1.2.6 pET28a-p19重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的pET28a-p19重组质粒大肠埃希菌接种于5 mL的LB培养基（卡那霉素终浓度50 μg/mL）中，37℃振荡培养过夜。取1 mL过夜培养物接种入10 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡（180 r/min）培养至A600约0.6～0.8时，留取1 mL做对照，随后加入IPTG（终浓度1 mmol/L），分别在加入IPTG后的第1、2、4、6小时取1 mL菌液，将菌液离心15 min，弃上清。

1.2.7 SDS-PAGE鉴定 将菌体沉淀内加入100 μL 1X SDS蛋白质上样缓冲液，混匀后经沸水水浴5 min，取20 μL样品进行SDS-PAGE电泳。以诱导前的BL21菌体裂解蛋白作对照，同时加入Fermentas蛋白分子量标准，加于5%浓缩胶和12%分离胶中进行SDS-PAGE电泳，100 V稳压，电泳2 h。凝胶经考马斯亮蓝G-250染色，再经甲醇/冰乙酸脱色过夜，观察结果。

1.2.8 p19蛋白纯化 挑取鉴定正确的单个菌落，于37℃100 mL含卡那霉素LB培养液中过夜，次日转种于900 mL LB培养基中振荡培养1 h，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L进行诱导，4 h后离心收集、洗涤菌体，加入8 mol/L尿素溶解后超声波裂解细菌，离心后取上清经Ni-NTA琼脂糖树脂柱纯化，获得融合蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE鉴定，-20℃保存。

2 结果

2.1 p19基因PCR扩增结果分析

使用设计引物，采用PCR方法从BCG基因组DNA中获得特异性高的DNA片段，并且大小与预计相符，约为479 bp（图1）。

图1 19 ku脂蛋白PCR产物

2.2 pET28a-p19的构建与鉴定

将目的基因与pET28a载体连接后，酶切鉴定及PCR鉴定均证实确有一大小为479 bp的片段插入载体，命名为pET28a-p19（图2），对筛选的阳性转化子进行测序表明，与结核杆菌的p19基因完全一致。

图2 pET28a-p19重组质粒鉴定

2.3 重组pET28a-p19的表达

含重组表达质粒的大肠埃希菌BL21经IPTG诱导，超声裂解后取菌体裂解液经过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后，可见重组菌中表达了分子量约为19 ku的一条蛋白带，在4 h表达量最佳（图3），对照含空质粒的大肠埃希菌则无此条带。

2.4 p19蛋白纯化

经Ni-NTA琼脂糖树脂柱纯化后，获得复性蛋白，经过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，可见纯化好的蛋白条带（图4）。

图3 重组蛋白pET28a-p19的SDS-PAGE分析

图4 纯化重组蛋白pET28a-p 19的SDS-PAGE分析

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，它危害人类健康历史较长。近年来，由于世界人口的剧增、肿瘤疾病的发生、结核菌株变异和耐药性产生、HIV感染流行等种种原因，在世界上许多地方出现结核病发病率回升的现象，尤其是在包括我国在内的发展中国家结核病发病率居高不下，已经严重地制约社会发展和降低了人民生活水平。结核杆菌脂蛋白p19蛋白是存在结核杆菌菌体中的一种小分子蛋白，结核杆菌进入巨噬细胞后，可阻碍巨噬细胞递呈抗原，使得结核杆菌进入静息状态，但该过程影响机制尚不明确。结核杆菌p19蛋白可通过与Toll样受体-2（Toll-like receptor 2，TLR-2）作用抑制IFN-γ在人巨噬细胞的信号转递，从而使巨噬细胞表面HLA-DR类分子的表达减少，可减弱其抗原递呈能力［4］，对结核杆菌在巨噬细胞中长期存活具有重要作用。因此笔者认为结核杆菌p19蛋白在结核杆菌形成静息状态中可能发挥加大作用，在研究该作用中结核杆菌p19蛋白的获得是十分重要的步骤。

本实验成功构建了可产生结核分枝杆菌19 ku脂蛋白的大肠埃希菌，重组质粒经酶切鉴定后与预期结果相符，其DNA序列经测序和BLAST比对后也完全正确。由于表达载体pET28a上携带组氨酸标签（His Tag），它可通过含有镍的蛋白层析树脂进行纯化，通过该方法获得了p19融合蛋白，并通过蛋白质电泳鉴定正确。p19融合蛋白的成功获得有助于进一步研究p19蛋白通过Toll受体-2抑制巨噬细胞递呈抗原的能力的相关机制。

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