武汉地区肝癌患者中HBV基因型分析

韩 雪，黄 晶，杨卫萍

（1.江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056，2.江汉大学 附属医院，湖北 武汉 430015）

原发性肝癌 （primary hepatocellular carcinoma，PHC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发国家，患病人数占全世界的45%， 同时也是乙型肝炎的高发国家［1－2］， 研究表明，乙型肝炎病毒持续感染与肝癌的发生密切相关［3－4］。 本文对原发性肝癌患者HBV感染情况及基因型情况做相关分析和研究，探讨HBV感染亚型与原发性肝癌的相互关系。

1 材料与方法

1.1 病例选择

湖北省肿瘤医院肝癌患者血清50例。全部病例符合国家卫生部制定的PHC诊断标准。

1.2 引物

引物设计参照文献 ［5］，由上海杰瑞生物工程有限公司合成，序列如表1所示。

1.3 HBV 基因组提取

参照文献［6］的方法，血清样品经过灭活后，取 100 μL 血清加 20 μL 裂解液（10 mmol／L Tris-HCl， 1 mmol／L EDTA， 15 mmol／L NaCl， 0.5%SDS， pH 8.0）， 混匀， 煮沸 10 min， 5000 g离心10 min，取上清液备用。

1.4 HBV DNA 的检测

利用HBV特异性检测引物，对血清提取的基因组进行PCR。

表1 设计引物序列

1.5 HBV 基因型分析

采用分型特异性引物巢式PCR进行，HBV基因分型引物根据HBV基因序列资料及参考文献［5］设计，引物序列见表1。分型特异性引物巢式PCR条件：第一轮PCR反应参数为：95℃6 min，94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环，再72℃10 min。第二轮PCR分两组进行，先按表1分成A组（包括A、B、C基因型）和B组（包括D、E、F基因型）加引物，再分别加入第一次PCR产物1 μL。第二轮PCR反应参数为：95℃6 min，按94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s进行50个循环之后，再72℃ 7 min。阴性对照以灭菌去离子水取代血清DNA提取物作为模板。

1.6 电泳检测

反应后，分别取第二轮扩增产物5 μL于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色后，凝胶电泳分析系统观察结果。

2 结果

2.1 肝癌血清中HBV基因的检测

如图1所示，以从病人血清中提取的HBV基因组作为模板，应用HBV检测引物进行聚合酶链式反应，聚合酶链式反应结果显示在DL2000的 1.0 kbp 带 和 1.25 kbp 带 之 间 有 一条特异性的条带，大小为1042 bp，与预期的1042 bp相符，表明HBV基因被检测出。

图1 肝癌血清中HBV基因的检测结果

2.2 肝癌血清中HBV基因分型的检测

巢式PCR进行HBV基因型分析。根据第二轮电泳结果判断片段大小与预期片段的分子相符合，做出基因型的判断，见图2和图3。由图2、图3可知，应用HBV分型检测引物进行聚合酶链式反应，聚合酶链式反应结果显示HBV B型在DL2000的200～400 bp处有一条特异性的条带，与预期的280 bp相符合，表明HBV B型被成功检出，HBV C型在DL2000的100～200 bp处有一条特异性的条带，与预期的120 bp相符合，表明HBV C型被成功检出。

图2 HBV B型分型引物PCR产物结果

图3 HBV C型分型引物PCR产物结果

2.3 统计分析

在已确诊的原发性肝癌样品中，通过患者血清提取基因组，检测血清基因中HBV感染及基因型情况发现：在50份样本中，HBV基因阳性结果为44例；在44例HBV阳性样本中，进行检出HBV A～F基因检测，其中HBV C基因阳性样本30例，B型阳性样本14例。

3 讨论

原发性肝癌的发生机制至今尚未研究清楚，近期研究表明HBV感染与肝细胞癌（HCC）的发生紧密联系，其中HBV X蛋白在HCC的发生中发挥了重要的作用［7-8］。因此，HBV感染后导致的肿瘤相关基因甲基化异常及肝脏代谢异常被认为是HCC形成的重要原因，而在HBV的各亚型中，HBV C型较其他亚型更容易引起严重的肝损伤并进而形成肝硬化和原发性肝癌。本研究通过对收集的原发性肝癌患者血清50例检测其HBV基因型感染情况，44例患者HBV DNA呈阳性，其中30例为C型占68%，14例为B型占32%。通过分析，武汉地区原发性肝癌患者88%为HBV感染患者，而且以HBV C型感染为主。

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