不同花色铁棒锤基因组DNA提取及遗传差异分析

朱田田 ，杜 弢 ，陈红刚 ，晋 玲 ，林 丽 ，侯 嘉

（1.甘肃中医学院药学系，甘肃兰州730000；2.甘肃省高校中（藏）药化学质量研究省级重点实验室，甘肃兰州730000）

铁棒锤为毛茛科乌头属植物铁棒锤（Aconitum pendulum Busch）的干燥块根[1]。其性热，味辛苦，有大毒，具有祛风除湿、消肿止痛、活血祛瘀之功效[2]。其长期以来一直以野生资源入药，随着市场需求的增加，人工驯化栽培已显得日益迫切。经调查，目前甘肃省仅永登县有少量的人工种植，其种子来源于野生，在栽培群体中有黄花和紫花2种类型，从表型上看，二者有区别，但仅从形态学方面不能说明二者的真正差异性[3]。因此，对其进行遗传差异分析十分必要，可为进一步选育产量高、品质好的新品种提供遗传基础。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）技术自1990年由Williams等发展起来后，因其快速、灵敏、程序简便等优点，短时间内被广泛应用于基因定位、连锁图的建立、品系（种）鉴别等方面[4-7]。其基本原理是采用随机序列较短的单个引物，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增产物可在琼脂糖凝胶电泳中分离成不同大小的DNA片段，遗传差异越大的品种其扩增产物的区别越明显。本研究拟利用RAPD技术对2种不同花色铁棒锤进行遗传分析，从分子水平阐明二者的差异。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 2008年8月，在甘肃省永登县采集不同花色铁棒锤的新鲜叶片，置于冰盒中带回实验室，储存于低温冰箱（-40℃）中；9月采集种子，自然干燥后放入纸袋保存于实验室阴凉干燥处。植物样品均由甘肃中医学院生药实验室林丽高级实验师鉴定。

1.1.2 仪器设备 数显恒温水浴锅（HH-S24），台式高速冷冻离心机（TGL16M），电泳仪（DYY-7），PCR 扩增仪（PE-2400），涡旋混合仪（WH-3），紫外分光光度计（UV-759），凝胶成像系统（Bio-Rad），等。

1.1.3 主要试剂 CTAB，EDTA，Tris，PVP，β- 巯基乙醇，均购于北京鼎国生物技术有限责任公司；RNA 酶，琼脂糖（Agarose），EB，PCR 相关试剂，均为上海生工生物工程有限公司产品；随机引物，购于北京博迈德科技发展有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及浓度检测 基因组DNA提取采用CTAB法[8-12]，具体步骤为：称取黄花和紫花铁棒锤新鲜叶片各150 mg和干燥种子各30 mg置于洁净干燥研钵中，加入适量PVP，与液氮共研成细粉后迅速转入2 mL离心管中；加入800 μL经65℃预热的CTAB提取缓冲液（2%CTAB，20 mmol/L EDTA（pH 值为 8.0），100 mmol/L Tris-HCl（pH 值为 8.0），1.4 mol/L NaCl，2%β-巯基乙醇），充分混匀，65℃水浴40 min，期间每隔10 min颠倒混匀1次；冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻颠倒混匀后静置5 min，12 000 r/min离心10 min；仔细吸取上层水相至新离心管中，重复此步骤2～3次，直到分界层无白色沉淀为止。取上清液于新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，10 000 r/min离心2 min；将离心管中上清液倒掉后倒置于纸巾上10 min，充分吸出水分后，加300 μL去离子水，涡旋混匀，使沉淀物溶于其中，65℃水浴5 min，充分溶解DNA后加入4 μLRNA酶（10 mg/mL），37 ℃水浴 10 min，除去RNA；再加入2/3体积的异丙醇，1/10体积的5 mol/L乙酸钠轻轻混匀，于-20℃放置30 min沉淀DNA；12 000 r/min离心10 min，小心倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底，加70%乙醇700 μL洗涤沉淀2～3次；室温干燥后加入130 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀，并保存于4℃冰箱中备用（-20℃长期保存）。

基因组DNA电泳检测：取5 μLDNA样品与1 μL TE缓冲液混匀后点样于0.8%琼脂糖凝胶孔，电泳缓冲液为1×TBE溶液，175 V电压下电泳25 min左右，EB（溴化乙锭）染色，用凝胶成像系统照相，保存。

DNA浓度和纯度检测：用无菌去离子水（57 μL）将基因组 DNA母液（3 μL）稀释 20倍后，使用紫外分光光度计测定在260，280 nm处的紫外吸收值。根据A260/A280的值判断总DNA纯度，并计算其浓度。

1.2.2 RAPD-PCR扩增及电泳检测 采用20条随机引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，反应体系为25 μL，含20 mmol/L Mg2+的Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.62 μL，10 μmol/L 引物 1.25 μL，2 U/μL Taq 酶 0.3 μL，DNA 模板60 ng。扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性50 s，37 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，40 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA电泳检测结果

铁棒锤2种不同组织提取的基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

图1表明，从亮度看，采用CTAB法从铁棒锤的新鲜叶片和干燥种子中均可提取出基因组DNA，但从种子中得到的电泳谱带明亮程度较新鲜叶片暗很多，说明从种子中提取的总DNA量低，而叶片提取的量高；从2种材料中提取的基因组DNA的电泳条带均比较整齐无拖尾，点样孔附近无杂质污染，说明CTAB法提取的DNA纯度高、质量好，比较适用铁棒锤基因组DNA的提取。

2.2 基因组DNA紫外分光光度计检测结果

对2种不同铁棒锤组织中提取的基因组DNA进行紫外检测分析（表1）表明，2种材料中提取的基因组DNA的A260/A280值均未达到1.8，说明所得到的DNA在不同程度上都含有一些杂质，如蛋白质、多酚及其他小分子物质等，但从总体看，其A260/A280值均在1.69以上，这已能满足对DNA模板质量要求相对比较低的RAPD-PCR扩增；2种材料提取的基因组DNA质量浓度为56～109μg/mL，按每次PCR的DNA用量为50ng计算，从数量上可以满足大量PCR扩增的需要。

表1 不同植物材料基因组DNA的纯度和质量浓度

2.3 RAPD-PCR扩增产物检测结果

20条随机引物中共有3条能扩增出条带，即 E68629，E68631，E68636，其中，引物 E68629的扩增产物清晰稳定，可用于铁棒锤遗传差异分析。从图2可以看出，2种花色的铁棒锤RAPD扩增产物具有一定的差异性，二者在1 500 bp处有共同条带出现，紫花铁棒锤在1 250，750 bp处有2条特异带，而黄花铁棒锤在1 000 bp处有1条特异带出现。说明二者存在遗传学差异。

3 讨论

CTAB法是植物基因组DNA提取的有效方法之一，对于药用植物铁棒锤也不例外。目前，从新鲜叶片中提取基因组DNA是大多数研究者的首选，但前提条件是样本必须足够新鲜，否则得到的DNA会产生不同程度的降解，而如何保持叶片新鲜成为样品采集过程中的难题。因此，在采样地点较远、叶片不易保存的情况下，改变样品采集部位可解决此问题。除叶片外，植物体其他组织都能提取出DNA，如种子、花粉等，尤其种子中常贮藏较多的蛋白和淀粉，一般不影响基因组DNA的提取效果[13]，这与本研究结果一致。

2种不同花色的铁棒锤除了在形态学上有差异外，经过RAPD分析得知，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段有区别，除了有1条共同带外，紫花和黄花铁棒锤还分别出现了2条和1条特异带，说明二者的基因型不同，其在遗传学上也具有一定的差异性。但由于供试材料单一，能够扩增出条带的随机引物数量较少，不能满足遗传多态性和遗传距离的分析，这也是今后研究中需要解决的问题。

[1]中华本草编委会.中华本草藏药卷[M].上海：上海科学技术出版社，2002：274.

[2]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编：上册[M].北京：人民卫生出版社，1975：703-704.

[3]郭宝生，刘素恩，王凯辉，等.表观遗传研究在棉花育种中的应用[J].河北农业科学，2010，14（4）：75-77.

[4]王海岗，吕建珍，彭锁堂.作物种质资源遗传多样性的评价方法[J].山西农业科学，2007，35（11）：26-27.

[5]莫可元.RAPD技术在中药鉴定及相关领域应用的研究进展[J].中国药师，2007，10（9）：908-910.

[6]塔娜，逯晓萍，张雅慧，等.皮、裸燕麦种质资源的性状表现和遗传差异分析[J].内蒙古农业科技，2010（2）：33-35.

[7]王铁固，杨天佑，赵新亮，等.离子束介导遗传转化小麦突变体的遗传分析[J].河南农业科学，2010（5）：11-15.

[8]顾红雅，瞿礼佳.植物基因与分子操作[M].北京：北京大学出版社，2005.

[9]Zhou Y Q.Application of DNA molecular markers technique to plant research[M].Beijing：Chemical IndustryPress，2005.

[10]叶丽娟，禄久幸.蜡梅花瓣基因组DNA提取及RAPD-PCR反应体系优化[J].山西农业科学，2011，39（4）：299-303.

[11]刘志刚，范丙友，史国安.上海牡丹根际土壤DNA提取方法研究[J].天津农业科学，2011，17（1）：84-87.

[12]韩玉杰，贾炜珑，王自霞，等.几种提取植物DNA方法的比较[J].山西农业科学，2008，36（7）：17-19.

[13]易红梅，张芳，王凤格，等.不同取样方式对DNA快速提取效果的影响[J].华北农学报，2007，22（5）：114-116.