黄芪多糖注射液对鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

韩中保 李荣良 韩扣兰

（盐城卫生职业技术学院，盐城 224005）

间充质干细胞（MSC）是属于中胚层的一类多能干细胞，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝脏细胞和神经细胞等多种细胞分化的能力，可来源于骨髓、脐带、皮肤、肺脏等多处组织器官。骨髓MSC还参与构成造血干细胞生存和分化的微环境，自体获取的骨髓MSC 回输后不发生免疫排斥反应，体外基因转染率高，但骨髓中MSC 的含量非常少。黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。黄芪多糖是黄芪主要成份之一，具有全方位的免疫调节和改善骨髓造血等作用。为了探讨其对间充质干细胞的影响，我们通过体内、体外实验研究了黄芪多糖注射液对MSC增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

选取2月龄体重200～250g健康SD 大鼠30只，雌雄兼用（上海斯莱克实验动物有限公司）；淋巴细胞分离液（天津TDB 生物有限公司）；LDMEM、胰蛋白酶（美国GIBCO 公司）；活细胞计数（CCK－8）试剂盒（日本株式会社同仁化学研究所）；5－溴尿嘧啶核苷（Brdu）（Sigma公司）；黄芪多糖注射液（250mg／瓶，天津赛诺制药有限公司）；生物素山羊抗大鼠IgG（博士德二抗试剂盒）；DAB 显色剂（博士德生物工程有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 取2只SD 大鼠的股骨和胫骨，用DMEM 冲出骨髓。将冲出的骨髓和DMEM 混合液离心（1.5×103r／min）5min，去上清液后，用DMEM 制成悬液。用吸管沿管壁将悬液慢慢加入已装有4ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面，1.9×103r／min水平离心20min。用吸管小心吸取中层白色雾状的细胞层，无血清DMEM 液洗涤两次，然后用含15%小牛血清的DMEM 培养液重悬，5×105／ml接种，37℃、5%CO2孵箱培养。第5天，第1次换液，此后每7d换液两次。

1.2.2 加药培养 待细胞接近融合时，按1×104／ml传代，传至第3 代时，将细胞浓度调为2×105／ml，接种于96孔板（每孔100μl），培养24h；吸去上清液，每孔加不含血清的DMEM 溶液100μl，培养24h；吸去上清液，每孔加100μl含15%小牛血清的DMEM 培养液，同时加入黄芪多糖注射液（用生理盐水稀释为300、150、75、37.5、15mg／ml），每个浓度3个重复孔。3个阴性对照孔加等量的生理盐水，培养48、72h，用CCK－8法检测黄芪多糖注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。

1.2.3 CCK－8 法检测MSC 增殖 细胞接种于96孔板上干预24h 后，每孔加入CCK－8 试剂10μl，继续培养3h 后，在酶标仪上读取450nm 的吸光度，用吸光值A 表示。每组设3 个重复孔，另设空白孔调零［1］。

1.2.4 Brdu表达的检测 将28只大鼠随机均分为黄芪多糖注射液组和生理盐水组。黄芪多糖组每只肌注黄芪多糖注射液0.2 ml（含黄芪多糖25 mg）；阴性对照组每只注射等量生理盐水0.2 ml，qd，连续5d。在连续注射的第3、4天，每只腹腔注射1ml Brdu（10mg／ml）。停药后第1天开始每组每天随机取大鼠2 只，连续5d，进行MSC 原代培养。每组MSC培养至第2代时，制成2×105／ml细胞悬液，滴于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，制成爬片，每组3张。余下大鼠（每组4只）继续喂养，观察其注射黄芪多糖注射液和生理盐水后MSC 的活力。从Brdu免疫组化的细胞爬片上可以观察到两组均有Brdu阳性细胞的表达。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪多糖注射液对MSC增殖的影响

300、150、75、37.5mg／ml浓度黄芪多糖组的吸光值与生理盐水组比较有显著差异（P＜0.05），且呈剂量依赖关系，而15 mg／ml浓度黄芪多糖组的吸光值与生理盐水组比较未见明显差异（P＞0.05）。不同药物浓度、24与48小时之间的吸光度也存在一定差异，但不显著（见表1）。

表1 不同组别间吸光度值比较（）Table 1 Compare of absorbance in different groups（）

表1 不同组别间吸光度值比较（）Table 1 Compare of absorbance in different groups（）

注：与生理盐水组比较，＊P＜0.05

2.2 黄芪多糖注射液对MSC Brdu标记阳性细胞数的影响

Brdu标记阳性率在用药后逐渐升高，5天达到峰值，后渐下降（见表2），用药后2～5 天黄芪多糖组与生理盐水组比较有显著性差异（P＜0.05）。

表2 MSC Brdu标记阳性细胞数（）Table 2 Compare of Brdu－positive MSC in different groups（）

表2 MSC Brdu标记阳性细胞数（）Table 2 Compare of Brdu－positive MSC in different groups（）

注：与生理盐水组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 讨论

MSC治疗是通过移植自体、异体MSC 进入宿主体内，以补充、替代或纠正某些组织细胞的数量或质量异常的技术手段。MSC 因为体外易扩增与纯化，移植到体内免疫原性低，目前已成临床治疗研究的热点。许多动物与临床研究均证实MSC 移植治疗安全有效，但如何进一步提高移植效果是目前亟待解决的课题。

黄芪多糖对许多细胞的增殖、分化及分泌有影响。黄芪多糖能提高树突状细胞（DC）表面分子CD40、CD80、HLA－DR 的表达，经黄芪多糖诱导的DC活化的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK），对A549肺腺癌细胞的杀伤活性高于单纯DC－CIK 细胞［2］。黄芪多糖通过降低人心脏微血管内皮细胞表面细胞间黏附分子1蛋白表达，进而抑制与外周血中性粒细胞的黏附，从而对缺血再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞具有 保护作 用［3］。大量 研究［4－6］显示 注射黄芪多糖能使正常及化疗小鼠骨髓、脾及外周血中的造血干细胞有不同程度的增加，能刺激人外周血单核细胞产生G－CSF 和GM－CSF 造血细胞因子，且呈明显的量效关系和时效关系。我们将5个不同浓度的黄芪多糖注射液直接加入大鼠骨髓MSC 培养液中，作用24、48h，用CCK－8法观察发现，300、150、75、37.5mg／ml 4个浓度对MSC 具有显著的增殖效应。SD 大鼠肌肉注射黄芪多糖，用Brdu标记增殖MSC，免疫组化方法显示，用药后，黄芪多糖组MSC增殖能力明显增强，在给药后2d 就开始增殖，明显前移，5d达最高，到第9天仍然比生理盐水组高。因此，体内外实验均证实黄芪多糖注射液对骨髓MSC 具有显著的促增殖作用，能促进MSC 的生长，且呈剂量依赖性。黄进等［7］研究表明：APS含药血清可能主要促进MSCs 可溶性SCF 蛋白的表达，细胞外液中增多的SCF 进一步通过旁分泌作用促进了MSCs的增殖。当然对MSC 分化及细胞因子分泌的影响还有待进一步研究。

［1］Hamamoto R，Furukawa Y，Morita M，et al.SMYD3encodes a histone methyltransferase involved in the proli－feration of cancer cells［J］.Nat Cell Biol，2004，6：731－740.

［2］张嵩，牟晓燕，王红梅，等.黄芪多糖诱导的树突状细胞增强CIK细胞的杀伤作用［J］.中国免疫学杂志，2009，25（2）：140－142.

［3］陈立新，朱海燕，朱陵群，等.黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖及再灌注后内皮细胞与中性粒细胞黏附的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（27）：5382－5386.

［4］夏星，申萍，严翠娥，等.黄芪多糖在长期骨髓细胞培养中支持体外造血的作用［J］.中国中医药信息杂志，2003，10（4）：27－28.

［5］翁玲，刘学英，刘彦，等.黄芪多糖对小鼠骨髓及外周血造血干细胞的增殖及动员作用［J］.基础医学与临床，2003，23（3）：306－309.

［6］娄晓芬，张炳华，宋京，等.黄芪多糖对有核细胞分泌造血细胞因子的影响［J］.中药新药与临床药理，2003，14（5）：310－312.

［7］黄进，张进，徐志伟.黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用［J］.复旦学报（医学版），2011，38（4）：343－348.