高压二氧化碳对鲜榨西瓜汁杀菌效果和风味的影响

刘 野，赵晓燕*，邹 磊，胡小松，宋焕禄

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097；

3.中国环境管理干部学院，河北 秦皇岛 066004；4.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

高压二氧化碳对鲜榨西瓜汁杀菌效果和风味的影响

刘 野1，赵晓燕2,*，邹 磊3，胡小松4，宋焕禄1

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097；

3.中国环境管理干部学院，河北 秦皇岛 066004；4.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

为研究高压二氧化碳对鲜榨西瓜汁的杀菌效果及对风味的影响，采用高压二氧化碳(HPCD)技术对鲜榨西瓜汁进行处理。以95℃、1min热处理西瓜汁作为对照，考察30MPa、60min HPCD处理对西瓜汁中菌落总数、霉菌和酵母菌总数及典型风味化合物含量的影响；并探讨两种处理西瓜汁在4℃、30d贮藏过程中上述指标的变化情况。结果表明：95℃、1min热处理的杀菌效果略好于30MPa、60min HPCD处理，采用两种处理西瓜汁的微生物指标均符合《果、蔬汁饮料卫生标准》的要求；并且保质期满足鲜榨西瓜汁的消费要求。30MPa、60min HPCD处理对西瓜汁的典型风味化合物含量影响较小；贮藏过程中风味变化也较小。总体看来，HPCD处理更适合于鲜榨西瓜汁的加工。

高压二氧化碳；西瓜汁；杀菌；风味

高压二氧化碳(high pressure carbon dioxide，HPCD)技术是食品加工领域中一种新型非热杀菌技术。二氧化碳与压力的结合可以形成高酸的环境，在一定的温度和压强下对食品进行处理，可以杀死微生物，延长食品的货架期。在5～60℃之间，采用50MPa以下的压强的HPCD处理可以使西瓜汁中的微生物降低2～12个对数[1]。37℃、20MPa或42℃、30MPa HPCD处理可以显著杀灭苹果浊汁中的大肠杆菌[2]。由于HPCD技术的加工温度较低，能很好地保持食品原有的色、香、味、形和营养成分，并具有良好的杀菌性能，是适合于热敏性食品加工的良好方法[1]。

西瓜属于葫芦科植物，通常认为葫芦科植物的风味物质及其形成机理是相似的，由其中的脂肪酸分解形成的烯醇和烯醛类是葫芦科植物中典型的风味物质[3]。由于西瓜汁中存在大量的过氧化物酶(peroxidase，POD)，在有氧气存在的情况下，可以氧化风味物质导致西瓜汁风味的变化[4]。另外，高温可以加剧该氧化反应的发生，并且这些风味化合物自身还可以发生一系列的反应使西瓜汁风味快速劣变。因此，西瓜汁是一种低酸热敏性果汁，不适于进行热加工，难于保藏[5]。国内外科研人员通过添加抗菌剂、增稠剂以及微波杀菌等方法，对西瓜汁进行处理，这些方法在一定程度上改善了西瓜汁饮料品质，延长了保质期，但存在着营养成分损失严重，失去西瓜汁原有风味的缺陷，使西瓜汁一直无法进行工业化大规模生产[6-8]。因此，本实验采用HPCD技术对鲜榨西瓜汁进行处理，研究杀菌效果的同时，考察处理前后及贮藏过程中西瓜汁中典型风味物质含量的变化，为西瓜汁加工方式的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

京玲无籽西瓜，采收于北京市农林科学院蔬菜研究中心延庆农场，贮藏于10℃冷库。

蛋白胨、牛肉膏 北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、葡萄糖、氢氧化钠 北京化工厂；琼脂(进口分装) 日本Solarbio公司；顺-2-壬烯醇、反-2-壬烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醇、壬醛、邻苯二甲酸二乙酯、正己醛、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮、2-戊基呋喃、十一酸甲酯 美国Sigma公司；色谱级乙醇 美国J.T.Baker公司。

HPCD杀菌机 中国农业大学研制；Zealway灭菌锅 美国致微公司；HDL APPARATUS超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Incucell培养箱 德国MMM公司；GC-MS-QP2010气相色谱串联质谱 日本岛津公司；打浆机 中国珠海飞利浦公司；旋涡混合器 江苏海门市麒麟医用仪器厂；电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鲜榨西瓜汁的制备

将西瓜用蒸馏水清洗、擦干、称质量。取瓜瓤切块，于打浆机中破碎。用4层纱布过滤，将滤得的西瓜汁混匀，进行下一步处理。

1.2.2 鲜榨西瓜汁的热处理

将装有100mL鲜榨西瓜汁的玻璃饮料瓶置于常压条件下、95℃恒温水浴锅中加热，待西瓜汁中心温度达到95℃开始计时，并盖上瓶盖，达到处理时间1min后，立刻逐级冷却至室温。

1.2.3 鲜榨西瓜汁的HPCD处理

预先将处理釜消毒，消毒后盖上处理釜盖，将100mL鲜榨西瓜汁用泵注入预先设定温度的处理釜。经过5～10min的升压过程达到设定压强，西瓜汁在恒定的压强和温度下进行处理，处理时间达到后，经过约5～10min的卸压，将西瓜汁灌装入灭菌的塑料包装袋，迅速封口。置于冰水浴中冷却。

微生物实验参数设置：常温下，设定压强30MPa，处理时间分别为5、15、30、45、60min；设定时间为60min，压强分别为8、15、22、30MPa。

风味实验参数设置：常温下，设定压强分别为10、20、30MPa，处理时间为60min。

1.2.4 营养琼脂培养基的制备

1)组成成分：10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠、18g琼脂、1000mL蒸馏水。

2)制作方法：将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15% NaOH约2mL，校正pH值至7.2～7.4，加入琼脂加热煮沸，使琼脂融化。用烧瓶分装，121℃高压灭菌20min。

1.2.5 马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备

1)组成成分：300g马铃薯(去皮切块)、20g葡萄糖、20g琼脂、1000mL蒸馏水。

2)制作方法：将马铃薯去皮切块，加入1000mL蒸馏水，煮沸10～20min，用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化。用烧瓶分装，121℃高压灭菌20min。

1.2.6 微生物检测

根据GB/T 4789.1—2010《食品微生物学检验总则》检验菌落总数、霉菌和酵母菌总数[9]。

1.2.7 气相色谱内标法定量内标物溶液的配制

0.2%的内标物溶液：取0.2mL十一酸甲酯标准品于100mL容量瓶(为防止内标物的挥发，在瓶中先少放些色谱级乙醇)，用体积分数60%色谱级乙醇定容。

0.01%的内标物溶液：取0.5mL上述0.2%内标物溶液于10mL容量瓶，调整乙醇和水的比例进行溶解。

1.2.8 西瓜典型风味物质定量校正因子的确定

1)用移液管吸取邻苯二甲酸二乙酯和己醛标准品各0.1mL，顺-2-壬烯醇、反,顺-2,6-壬二烯醇、壬醛、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮、2-戊基呋喃和十一酸甲酯标准品各0.03mL加入到10mL容量瓶(预先加入2mL色谱级乙醇)，调整乙醇和双蒸水的比例进行溶解。

2)用移液管吸取上述配制的溶液1mL，加入到10mL容量瓶，调整乙醇和双蒸水的比例进行溶解。

3)取第2步中的溶液1mL，加入到100mL容量瓶，加入色谱级乙醇及大量的水，并控制乙醇含量在20%以下。

混合标准品中各组分及内标含量的计算公式：

式中：mi、ms为混标中各组分i和内标物s的含量/(mg/100 mL)；ci、cs为混标中各组分i和内标物s的体积百分含量；Vi、Vs为混标中各组分i和内标物s的体积/mL；di、ds为混标中各组分i和内标物s的密度/(g/mL)；1000为换算成以mg为单位的系数。

1.2.9 西瓜汁中典型风味化合物定量方法

每个样品取8mL加入到15mL玻璃萃取瓶中，加入0.05mL、0.01%的内标物溶液，使内标物在西瓜汁样品中的质量浓度为0.546mg/mL。

1.2.10 GC-MS操作条件

固相微萃取条件：将装有8mL西瓜汁的萃取瓶置于35℃恒温水浴30min，用100μm PDMS固相微萃取头对风味物质进行萃取。

GC条件：毛细管柱DB MS-5(30m×0.25mm，0.25μm)；升温程序：初始温度40℃，以8℃/min的升温速度升至220℃，进样口温度：250℃；总流速：27.5mL/min；分流比：20。

MS条件：离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂切割：1min；检测器电压：1.0kV；扫描范围：30～500m/z；扫描方式：全扫描。

谱图解析：NIST谱库。

1.2.11 西瓜汁的贮藏实验

进行95℃、1min热处理，30MPa、60min HPCD处理及600MPa、60min超高压处理的西瓜汁分别在4℃条件下贮藏30d。每隔5d取样一次进行菌落总数和霉菌、酵母菌总数的测定；每隔10d取样一次进行风味物质的测定。

1.2.12 数据分析

采用SAS 8.12进行因子方差分析及Ducan,s多重检验(P＜0.05)。实验结果以表示。

2 结果与分析

2.1 HPCD处理对鲜榨西瓜汁菌落总数的影响

初始阶段鲜榨西瓜汁中的菌落总数为3.6×103CFU/mL。表皮完好的新鲜西瓜内部果实组织中含有的微生物极少，不会对西瓜汁中微生物的数量产生决定性影响。因此污染鲜榨西瓜汁的微生物主要来源于环境及加工设备。鲜榨西瓜汁的灭菌主要是杀灭加工过程中污染的外源菌。

图1 HPCD处理60min过程中压强对鲜榨西瓜汁菌落总数的影响Fig.1 Effect of HPCD pressure on total bacterial count in watermelon juice

由图1可知，当处理时间为60min时，HPCD处理后菌落总数随着处理压强的升高而显著降低(P＜0.05)。HPCD处理8MPa以下时，菌落总数降低较小，表明细菌中部分细菌对压强具有一定的耐受能力。当压强继续增大时，菌落总数迅速降低，之后又呈缓慢降低的趋势，可能由于其中的一部分菌种具有较强的耐压性，在较高压强条件下仍然可以存活。在30MPa HPCD处理时，菌落总数降低至26CFU/mL，达到GB19297—2003《果、蔬汁饮料卫生标准》(以下简称《卫生标准》)要求(≤ 100CFU/mL)[10]。

图2 30MPa HPCD处理过程中处理时间对鲜榨西瓜汁菌落总数的影响Fig.2 Effect of HPCD treatment duration on total bacterial count in watermelon juice

由图2可知，当处理压强为30MPa时，HPCD处理后菌落总数均随着处理时间的延长而显著降低(P＜0.05)，并且菌落总数的降低总体上呈现先快后慢的趋势。这可能由于在中等强度的压强下，部分耐压能力较弱的菌种迅速被杀灭；而延长处理时间对耐压菌的杀灭效果不明显，所以其中的耐压菌仍然可以存活。在 HPCD处理45min和60min后，西瓜汁中的菌落总数分别为73CFU/mL和26CFU/mL，均达到《卫生标准》要求。而95℃、1min的热处理后西瓜汁中的菌落总数降至7CFU/mL，具有很好的灭菌效果，使西瓜汁达到《卫生标准》要求。

2.2 HPCD处理对鲜榨西瓜汁霉菌和酵母菌总数的影响

图3 HPCD处理60min过程中压强对鲜榨西瓜汁霉菌和酵母菌总数的影响Fig.3 Effects of HPCD pressure on total mold and yeast count in watermelon juice

初始阶段鲜榨西瓜汁中的霉菌和酵母菌数为5.2×102CFU/mL。由图3可知，当处理60min时，HPCD处理后霉菌和酵母菌数均随着处理压强的升高而显著降低(P＜0.05)。开始阶段呈快速线性下降，说明霉菌和酵母菌的耐压性比细菌差。在30MPa HPCD处理时，西瓜汁中的霉菌和酵母菌数为9CFU/mL，达到《卫生标准》要求(≤20CFU/mL)。

图4 30MPa HPCD处理过程中处理时间对鲜榨西瓜汁霉菌和酵母菌总数的影响Fig.4 Effects of HPCD treatment duration on total mold and yeast count in watermelon juice

由图4可知，当处理压强为30MPa时，HPCD处理后霉菌和酵母菌总数随着处理时间的延长而显著降低(P＜0.05)。0～5min霉菌和酵母菌总数迅速降低，而后下降速度变缓，到60min时降低到9CFU/mL；而95℃、1min的热处理后西瓜汁中的霉菌和酵母菌总数降至3CFU/mL，具有很好的灭菌效果，使西瓜汁达到《卫生标准》要求。

2.3 HPCD处理鲜榨西瓜汁贮藏期内菌落总数的变化

由图5可知，两种处理西瓜汁中的菌落总数均随着贮藏天数的延长而显著增加(P＜0.05)。在4℃条件下，热处理西瓜汁贮藏25d和HPCD处理西瓜汁贮藏15d的菌落总数均在《卫生标准》中的菌落总数临界值100CFU/mL范围内。

图5 热处理和HPCD处理西瓜汁贮藏过程中菌落总数的变化Fig.5 Changes in total bacterial count in thermally treated watermelon juice and HPCD treated watermelon juice during storage

2.4 HPCD处理鲜榨西瓜汁贮藏期内霉菌和酵母菌总数的变化

图6 热处理和HPCD处理西瓜汁贮藏过程中霉菌和酵母菌总数的变化Fig.6 Changes in total mold and yeast count in thermally treated watermelon juice and HPCD treated watermelon juice during storage

由图6可知，两种处理西瓜汁中的霉菌和酵母菌总数随着贮藏天数的延长而显著增加(P＜0.05)。在4℃条件下，热处理西瓜汁贮藏25d和HPCD处理西瓜汁贮藏20d内的霉菌和酵母菌总数均在《卫生标准》中的霉菌和酵母菌总数临界值20CFU/mL范围内。总体看来，与贮藏过程中菌落总数的结果一致。由于鲜榨西瓜汁是不添加任何防腐剂，并要在7d之内消费掉的，从这一点来讲，热处理和HPCD处理均可以满足保质期的需要。

2.5 西瓜汁中典型风味物质定量校正因子

根据公式(1)和(2)，对同一类型的不同检测器来说，在组分i和s相同的情况下，相对校正因子是基本一致的。它只和检测器的性能、待测组分的性质、标准物质的性质、载气的性质相关，与操作条件无关。但是由于不同检测器的性能有一定的差异，因此相对校正因子需要在使用的色谱上单独测定[11]。

因此，本实验中通过西瓜汁中典型风味物质的标准品在气相色谱上的响应值与内标物响应值的比值，计算出一系列典型风味物质在所使用仪器上的相对校正因子，为西瓜汁中风味物质的定量做准备。如表1所示，通过几种典型物质在气相色谱上的峰面积以及在混合标准品中的质量浓度，代入公式计算出相对校正因子。

表1 西瓜汁中典型风味物质的校正因子Table 1 Correction factors of typical flavor compounds in watermelon juice

2.6 热处理对西瓜汁中典型风味物质的影响

图7 GC-MS测定未处理西瓜汁中风味物质的总离子流图Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of native untreated watermelon juice

图8 GC-MS测定95℃、1min热处理西瓜汁中风味物质的总离子流图Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of thermally treated watermelon juice

通过图7、8的对比可以看出，95℃、1min热处理以后西瓜汁的风味发生了明显的变化。并且通过表2中风味物质含量的对比得出，热处理后的西瓜汁中典型风味物质的含量大多显著下降(P＜0.05)，反,顺-2,6-壬二烯醇的含量已检测不到。其中己醛、反-2-壬烯醛、顺-2-壬烯醇、壬醛和邻苯二甲酸二乙酯含量分别降低了42.7%、87.1%、58.1%、53.8%和75.8%。同时，在热处理后的西瓜汁中又生成了一些在鲜榨西瓜汁中不存在的风味成分，比如壬酸、8-甲基-1-十一烯、2-甲基十三烷、4-己基氨基甲酰基丁酸和3,3-二甲基庚烷等。原有风味物质的损失和新生成的风味物质的共同作用，导致了热处理西瓜汁风味的严重劣变。

表2 热处理前后西瓜汁中典型风味物质的含量变化Table 2 Typical flavor compounds in control and thermally treated watermelon juices

2.7 HPCD处理对西瓜汁中典型风味物质的影响

图9 GC-MS测定不同压力HPCD处理60min西瓜汁中风味物质的总离子流图Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of HPCD treated watermelon juice

通过图9a、b、c的比较得出压强对西瓜汁风味物质造成了一定影响。进一步通过表3中各风味化合物含量的比较得出，经过30MPa、60min HPCD处理后的西瓜汁中，反-2-壬烯、壬醛、2-戊基呋喃含量不发生显著性变化(P＞0.05)；6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮的含量上升(P＜0.05)；己醛、顺-2-壬烯醇、反,顺-2,6-壬二烯醇、邻苯二甲酸二乙酯均呈现逐渐降低的趋势，分别降低了31.5%、17.9%、80.4%和92.0%。其中反,顺-2,6-壬二烯醇、邻苯二甲酸二乙酯含量降低最多，这也与热处理西瓜汁中的结果是相一致的。HPCD处理导致西瓜汁中典型风味物质含量降低是由于二氧化碳对酯类、醇类具有一定的萃取作用[12-14]。虽然经过30MPa、60min HPCD处理后西瓜汁中的典型风味物质的含量也大多呈下降趋势，但其降低的幅度要小于95℃、1min热处理，说明在保持西瓜汁风味方面，30MPa、60min HPCD处理要优于95℃、1min热处理。但是，与未处理西瓜汁相比，HPCD处理后的西瓜汁中仍然生成了一些新的风味化合物。如十五烷、8-甲基-2-癸烯、2,6,10-三甲基十二烷、10-十二碳烯醇、6,10,14-三甲基十五碳-5,9,13-三烯-2-酮等，这些化合物的生成会对西瓜汁的风味造成一定影响。但通过比较看出，图9中新增化合物的种类和相对丰度明显少于图8，因此从含量来看HPCD处理可以更好的保持西瓜汁的风味。

表3 HPCD处理前后西瓜汁中典型风味物质的含量的变化Table 3 Typical flavor compounds in control and HPCD treated watermelon juices

2.8 热处理和HPCD处理西瓜汁贮藏过程中典型风味物质的变化

从表4可以看出，95℃、1min热处理西瓜汁在4℃条件下贮藏30d的过程中，其中的己醛、反-2-壬烯醛、壬醛、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮和2-戊基呋喃含量不发生变化(P＞0.05)；而顺-2-壬烯醇和邻苯二甲酸二乙酯的含量略有降低(P＜0.05)，分别降低了15.7%和48.8%。从表5可以看出，30MPa、60min HPCD处理西瓜汁在4℃、30d的贮藏过程中，风味物质的含量均不发生变化(P＞0.05)。果汁贮藏过程中风味的变化是由其中的内源酶如过氧化物酶、脂肪氧化酶和糖苷酶引起的[4,15]。与热处理相比，HPCD处理可以更好的钝化西瓜汁中与风味相关的内源酶活性，从而使处理后西瓜汁在贮藏过程中的风味得以更好的保持。

表4 95℃、1min热处理西瓜汁在4℃贮藏过程中典型风味物质的含量变化Table 4 Changes in typical flavor compounds in thermally treated watermelon juice during storage at 4 ℃

表5 30MPa、60min HPCD处理西瓜汁在4℃贮藏过程中典型风味物质的含量变化Table 5 Changes in typical flavor compounds in HPCD treated watermelon juice during storage at 4 ℃

3 结 论

95℃、1min的热处理后西瓜汁中的菌落总数、霉菌和酵母菌总数分别降至7CFU/mL和3CFU/mL；而30MPa HPCD处理后，两者分别降至26CFU/mL和9CFU/mL，均达到《果、蔬汁饮料卫生标准》要求。并且贮藏15d之内菌落总数、霉菌和酵母菌总数仍在卫生标准要求范围内。与本研究不同，前人的报道中通常认为HPCD处理比热处理具有更好的杀菌效果[16]。这可能由于本研究中HPCD处理的准备阶段对处理釜的消毒不彻底所致。

95℃、1min的热处理和HPCD处理均会导致西瓜汁典型风味化合物的含量变化，但HPCD处理对西瓜汁的风味影响较小；并且4℃贮藏30d的过程中HPCD处理西瓜汁的风味变化较小。

根据消费习惯，鲜榨果汁通常要在7d之内消费掉，因此该鲜榨西瓜汁的保质期只需7d。95℃、1min的热处理和30MPa HPCD处理在微生物指标方面均可以达到上述要求，而HPCD处理可以更好的保持鲜榨西瓜汁的风味，因此HPCD处理更适合鲜榨西瓜汁的生产。

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Effects of High Pressure Carbon Dioxide on Microbiological and Flavor Profiles of Fresh Watermelon Juice

LIU Ye1，ZHAO Xiao-yan2,*，ZOU Lei3，HU Xiao-song4，SONG Huan-lu1
(1.School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Vegetable Research Center, Beijing 100097, China；3. Environmental Management College of China；Qinhuangdao 066004,
China；4. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this study, the effect of high pressure carbon dioxide (HPCD) on the microbial indexes and flavor of fresh watermelon juice was investigated. The total bacteria, mold and yeast count, and typical flavor compounds of watermelon juice after treated with HPCD for 60 min at 30 MPa were analyzed and compared to those of samples thermally treated at 95 ℃ for 1 min.Microbial analysis was carried out on watermelon juice during 30 days of storage at 4 ℃.The results showed that better sterilization results were achieved by the thermal treatment than the HPCD treatment. The microbial indexes of watermelon juice samples sterilized by the different treatment methods were in line with the requirement of the national standardHygienicStandard for Fruit and Vegetable Juiceand could meet consumer demands for fresh watermelon juice within the shelf life. The HPCD treatment had little impact on typical flavor compounds of watermelon juice and little changes were observed during storage. In general, HPCD treatment is more suitable than heat treatment for fresh watermelon juice production.

high pressure carbon dioxide (HPCD)；watermelon juice；sterilization；flavor

O521.9；TS275.5

A

1002-6630(2012)03-0082-07

2011-03-17

北京市委组织部优秀人才项目(2011D005003000007)；国家“863”计划项目(2007AA100405)；

北京市重大科技计划项目(101105046610000)

刘野(1981—)，男，讲师，博士，研究方向为食品非热加工技术。E-mail：liuyecau@126.com

*通信作者：赵晓燕(1971—)，女，研究员，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：caucfsne@yahoo.com.cn