C－反应蛋白基因多态性与脑梗死

邓 可 肖志杰 黎肖弟

C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是重要的急性期蛋白，作为经典的炎症介质具有多种生理功能。炎症在动脉粥样硬化以及缺血事件的发生发展中起到重要的作用。数个前瞻性研究显示，单独测量血清CRP水平可作为首发和再发脑血管事件的危险预测因子［1～3］。国外的大量研究证实CRP与种族相关，目前国内尚无相关试验报道，本研究对此进行了研究，采用病例－对照研究，探讨rs1205基因多态性和缺血性脑卒中的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 脑梗死组来源于2007年7月～2007年12月在中南大学湘雅二医院神经内科急诊室留观或住院的中老年脑梗死患者105例，其中男75例，女30例；年龄37～92岁，平均年龄（64.1±11.4）岁；病程＜3 d；均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅CT／MRI证实。根据美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分，其中病情为轻度（NIHSS＜6）59例，中度（NIHSS6～13）36例，重度（NIHSS＞14）10例。体质量指数（BMI）24.12±6.40。伴有冠心病史30例，高血压病史92例，糖尿病史25例；脑卒中家族史21例，吸烟史46例，饮酒史18例。对照组为121名同期门诊体检者，其中男73例，女48例；年龄45～80岁，平均年龄（62.5±9.2）岁；BMI 23.74±3.05。伴有冠心病史15例，高血压病史28例，糖尿病史2例；脑卒中家族史2例，吸烟史16例，饮酒史8例。入组者排除伴随脑出血、合并周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病、大动脉炎、血液病、结核或明显肺部感染、恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者、曾接受器官移植者。脑梗死组和对照组在性别、年龄、BMI的差异无统计学意义（P＞0.05）。常见的危险因素如冠心病史、高血压病史、糖尿病史、脑卒中家族史、吸烟史及饮酒史脑梗死组明显高于对照组（P均＜0.05）。

1.2 血清h-s CRP水平测定 所有入选对象（脑梗死患者在发病24 h内，部分患者在发病的3 d内）采集清晨空腹静脉血2 ml，由本院检验科用Hitachi 7170A全自动生化分析仪，采用免疫透射比浊法测定超敏 C－反应蛋白（high-sensitive C reactive protein，h-s CRP）水平。

1.3 CRP基因型测定 取肘静脉血5 ml，采用低渗溶血、酚／氯仿法抽提外周白细胞基因组DNA，TE溶解保存；多聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性测定rs1205基因多态性，引物由博尚生物技术有限公司合成（表1）。

25μl PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5μl，Mg2＋25 mM1μl，4×dNTP25 nM1μl，上游和下游引物分别为10μM1μl，基因组DNA1μl，Taq酶5μ／μl 0.5μl，二甲基亚砜（DMSO）2.5μl。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。限制性内切酶消化反应体系20μl：PCR产物10μl，10×Buffer R2μl，内切酶2 U 酶切，37℃消化14 h。以pUC19DNA／MspI酶解片断作为DNA片断的标准物，20%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染（图1）。

图1 rs1205产物酶解片段20%聚丙烯酰胺凝胶电泳谱

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0软件包。多数计量资料近似正态分布，而CRP呈偏态分布，将其对数转换为Log CRP，经Kolmogorov-Smirnov检验近似正态分布（Z＝0.988，P＝0.283）再行检验。计量资料以均数±标准差（±S）表示，组间比较采用t检验；分类资料采用卡方检验；采用Logistic回归模型判断脑梗死危险因素作用的大小，分别计算各自的比值比（OR）及其95%可信区间（CI）。

2 结 果

2.1 脑梗死组与对照组基因型比较 在研究总人群（脑梗死组＋对照组）中rs1205基因型的频率分别为CC17.7%，CT48.2%，TT34.1%；等位基因C／T的频率分别为0.418和0.582，符合 Hardy－Weinberg平衡（χ2＝0.018，P＝0.894）。脑梗死组和对照组的基因型及等位基因的分布趋势相同，差异无显著性（P＞0.05）（表2）。

表2 脑梗死组与对照组rs1205基因型的比较

2.2 CRP基因型对CRP水平的影响 rs1205的CC、CT、TT基因型的Log CRP水平分别为（0.357±0.669）、（0.252±0.597）、（0.165±0.636）Log mg／L，基因型的血清Log CRP水平呈逐一下降趋势，但差异无显著性（P＞0.05）（表3）。

2.3 CRP水平对脑梗死严重程度的影响 在对脑梗死患者入院后立即用美国国立卫生院神经功能缺损评分（National Institues of Health Stroke Scale，NIHSS）将其分为3类：轻（NIHSS＜6）、中（6≤NIHSS≤13）及重（NIHSS≥14）。其中评分为重的h-s CRP和Log CRP水平均高于其他两组，统计学有显著性差异（P＜0.05）（表4）。

表3 CRP基因型对CRP的影响（±s）

表3 CRP基因型对CRP的影响（±s）

基因型 Log CRP（Log mg／L） P值rs1205 CC 0.357±0.669 0.309 CT 0.252±0.597 TT 0.165±0.636

表4 CRP水平对脑梗死严重程度的影响（±s）

表4 CRP水平对脑梗死严重程度的影响（±s）

注：与NIHSS轻、中组比较，＊P＜0.05

CRP水平 h-s CRP（mg／L）（中位数）Log CRP（Log mg／L）（images/BZ222.png±s）50中组（6≤NIHSS≤13）（n＝36） 4.06 0.52±0.67重组（NIHSS≥14）（n＝10） 28.99＊ 0.90±0.80轻组（NIHSS＜6）（n＝59） 2.91 0.43±0.＊

2.4 CRP基因型对脑梗死严重程度的影响 将脑梗死rs1205基因型与NIHSS评分制表如下，经χ2检验，rs1205基因型与脑梗死严重程度均无关联，统计学无显著性差异（P＞0.05）（表5）。

将三种基因型进行DNA序列测定。由测序图谱可以看出，CRP1846C＞T的PCR扩增产物序列CC型中的碱基C（图2－1中箭头所指）突变为TT型中的T（图2-3中箭头所指），这与酶切结果一致（图2）。

表5 CRP基因型×NIHSS交叉表

3 讨 论

动脉粥样硬化作为脑梗死的基因病因，越来越多的证据表明它是一个慢性炎性的过程。多个研究发现，年龄、性别、体重等多个临床相关指标影响血清CRP 水平［4，5］。rs1205单核苷酸多态性是 CRP常见多态性之一，位于3′-UTR区域。rs1205对h-s CRP水平影响的研究结果大相径庭［6，7］。本研究发现携带rs1205T等位基因的人群血清h-s CRP水平下降，但与CRP水平无显著关联。这可能与CRP的变化由多个因素影响，且遗传影响较低［8］有关。

图2 CRP1846C＞T PCR产物测序图谱

rs1205在不同种族和地区的分布不同。通过对PUBMED SNP数据库检索获得，rs1205T等位基因在欧洲人的分布频率为0.333；在非洲人群中为0.150；在中国北京地区为0.556。在本研究中中国湖南汉族健康人群中rs1205单核苷酸多态性位点有CC、CT、TT三种基因型；T等位基因频率分别为0.579。等位基因T的分布频率明显高于欧洲人群而与中国北京人群分布相似。由此可见T等位基因在不同种族的分布可存在差异。

许多研究都证实，CRP水平与缺血性脑卒中的发病相关［9，10］。而关于CRP基因多态性与缺血性脑卒中的关系却存在争议。Morita A等检测了4个人类 CRP基因SNP基因型：rs1341665，rs1800947，rs1130864，rs1205后发现仅rs1800947与缺血性脑卒中有显著关联［11］。Kuhlenbaeumer G［12］等对4个SNPs（rs3093075，rs1205，rs1130864，rs1800947）研究发现，没有相关的SNP位点或SNP单体型与整体的缺血性脑卒中相关，但三个单核苷酸多态性（rs3093075，rs1130864和rs1800947）与微血管闭室呈显著的关联。Wang Q等的研究没有发现rs1205与缺血性脑卒中相关，但单体型H3与缺血性脑卒中相关。本研究没有对脑卒中类型进行细分及构建单体型，研究发现重型脑梗死患者的hsCRP水平显著高于轻、中度组，rs1205基因型与脑梗死及脑梗死病情的严重程度均无关，与之前的结果一致。

本研究采用病例－对照配比研究，标本量偏小；本研究没有对脑卒中进行细分研究，研究结果与他人有差异，但可能与样本选择、种族差异等有关，有必要扩大样本量、多地区间进行比较，以进一步探讨。

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9 邓 可，肖志杰，赵水平，等.血清超敏C-反应蛋白水平及CRP 1059G／C基因多态性与脑梗死的相关性.临床神经病学杂志，2009，（6）：413-415.

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