红细胞贮存时间对脂多糖诱导的中性粒细胞炎症释放的影响

张莎娜 王海平 曹 惠 王全立

1.解放军总医院输血科，北京 100853；2.军事医学科学院附属医院输血科，北京 100071

血液及血液成分在储存过程中会发生损伤，红细胞自身的生化功能及形态也会发生改变。红细胞悬液中的白细胞和血小板会自发的释放许多生物活性物质，多数活性分子会随着贮存时间的延长而浓度升高。白细胞易崩解并释放各种细胞因子（白介素等）。已有临床报道，血液的贮存损伤会对心脏手术患者和创伤患者带来不良的临床效应[1]，但由于发生原因复杂、临床表现不明确，目前相关的临床报道仍存在争议。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引起急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要因素[2]。中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）是机体内重要的炎症反应细胞[3]，为数量最多的白细胞。细菌LPS可以刺激PMN产生多种炎症介质，但对其确切的内在机制了解甚少，为了解大量库存红细胞的输注对受者输血免疫功能的影响，本研究采用体外实验的方法，在LPS的诱导下，观察随红细胞保存时间的延长，对受者PMN炎症释放的作用。现总结报道如下：1材料与方法

1.1 试剂

LPS购自Sigma公司（试剂批号：L2880），中性粒细胞分离液购自天津市川页生化制品有限公司，IL-6和TNF-α试剂盒均购自北京欣博盛生物科技有限公司。

1.2 悬浮红细胞上清的制备

将制备好的悬浮红细胞于4℃保存，分别于1、21、35 d（D1、D21、D35）无菌条件下取出 30 mL，1 500 r/min 离心 20 min得到上清，再将上清12 500 r/min离心5 min，去除细胞后分装于-20℃冻存待集中测定。

1.3 全血中性粒细胞的分离、培养及分组

取9份健康献血者的全血，3 500 r/min离心15 min，得到富含白细胞的层面35～40 mL，分2～3次缓慢地等量加入到15 mL中性粒细胞分离液上，2 000 r/min离心25 min，吸取富含白细胞的中间层，再加入5倍体积以上的PBS，1 200 r/min离心10 min去除血小板；加入含 NH4Cl、NaHCO3溶血素2mL，37℃溶血 30min，溶解残存的红细胞；再加入少量的PBS，1 500 r/min离心10 min，去上清，余下的则为中性粒细胞；PBS洗涤2次，加入RPMI-1640培养液悬浮细胞。经Wright-Giemsa染色鉴定其纯度＞95%[4]，然后进行台盼兰排斥法证实其存活率＞98%。将细胞悬液浓度调整到2×106/mL，将红细胞悬液分为60份，分别进行测定。

24孔细胞培养板中每孔加入1.5 mL细胞悬液，细胞完全培养基由RPMI-1640、10%小牛血清、1%青链霉素组成（购自上海微科生化试剂有限公司）。本实验分为对照组和实验组，均各设一个空白对照，不加红细胞上清，只加完全培养基，其余分别加入含20%D1、D21、D35的红细胞上清的细胞完全培养基。对照组（30份）：未加LPS组，培养24 h后收集细胞培养上清；实验组（30 份）：先培养 12 h 加入 1.5 μL、100 μg/mL的LPS，再培养12 h收集细胞培养上清。将细胞培养板置于CO2细胞培养箱（37℃、湿度100%、体积分数5%CO2）中孵育。

1.4 细胞因子检测

收集细胞培养上清，12 500 r/min离心5 min，去除细胞，细胞培养上清中IL-6及TNF-α浓度采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，按产品使用说明书进行。

1.5 统计学方法

采用SAS 9.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用 t检验；以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞上清细胞因子的表达情况

在各时间点收集的未加PMN的红细胞上清中，均未检测到IL-6和TNF-α。

2.2 两组红细胞上清中IL-6水平比较

在LPS的诱导下，D35、D21红细胞上清中IL-6水平高于D1红细胞上清（P＜0.05），其浓度随红细胞上清保存时间的延长而增加。与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组D1、D21、D35红细胞上清中的IL-6水平高于空白对照，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组，D1、D21、D35的 IL-6水平分别比空白对照增长（1.32±0.05）、（1.65±0.08）、（2.14±0.13）倍。 D1、D21、D35 之间差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组D1、D21、D35红细胞上清中IL-6水平与对照比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组红细胞上清中IL-6水平比较（±s，ng/L）

表1 两组红细胞上清中IL-6水平比较（±s，ng/L）

组别 例数 空白对照 D1 D21 D35对照组实验组30 30 t值 P值83.04±35.61 384.73±45.82 28.48＜0.05 192.62±80.98 500.88±99.85 13.13＜0.05 275.84±80.26 634.45±99.71 23.90＜0.05 356.77±80.28 825.46±95.57 20.57＜0.05

2.3 两组红细胞上清中TNF-α水平比较

LPS诱导下，D35、D21的红细胞上清中TNF-α水平高于D1红细胞上清，但差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组D1、D21、D35红细胞上清中TNF-α水平与对照比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

目前全世界都面临血液资源日益紧张的境况，对于延长血液保存时间、提高血液保存质量的需求更为迫切。输血相关的免疫变化可能是红细胞、白细胞、血小板等储存过程中所产生的可溶性物质所引起的。LPS是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，是强有力的免疫炎症系统活化因子，可引起机体炎症反应，导致致死性感染性休克，病死率极高。本文参照文献[5]，按照LPS的剂量效应关系结果，选择LPS的终浓度为 100 μg/mL。 参照输血体外实验“双重打击”（two-hit）的模型[6]，采用LPS诱导，模拟临床严重创伤后患者的炎症反应。严重创伤患者在其救治过程中需要大量输血，这对患者的免疫功能影响很大。因此，培养PMN过程中加入20%上清，相当于50 kg体重的临床患者输注12～15U的悬浮红细胞。现有研究表明，输血相关的免疫反应可能与血液保存过程中产生的细胞因子有关。炎症细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α）主要由外周的免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）产生，通常介入免疫及炎症反应[7]，TNF-α能刺激巨噬细胞产生IL-1间接刺激体温中枢。本实验所检测的细胞因子均为参与炎症反应的重要的介质。TNF-α可促进炎症反应，引起白细胞与毛细血管内皮细胞的黏附，黏附的中性粒细胞被激活可促发损伤级联反应，导致水肿、炎症反应和缺血缺氧的恶性循环[8]。IL-6是炎症和急性期反应重要的细胞因子，其升高的水平与多器官功能衰竭风险增高有关。同时，IL-6和TNF-α共同作用上调免疫应答，是促进炎症反应、引起败血症的重要介质[9]。这两个细胞因子的变化可以间接解释输血引起的炎症反应。

表2 两组红细胞上清中TNF-α水平比较（±s，μmol/L）

表2 两组红细胞上清中TNF-α水平比较（±s，μmol/L）

组别 例数 空白对照 D1 D21 D35对照组实验组t值P值30 30 77.59±7.61 79.45±9.82 0.83＞0.05 84.10±9.85 86.34±10.46 0.85＞0.05 87.66±10.44 89.78±11.71 0.74＞0.05 93.77±11.28 95.46±12.57 0.54＞0.05

本实验结果显示，在LPS的诱导下，D35较D1红细胞上清促使PMN释放更多的TNF-α和IL-6，可以解释为库存血的输注增强了PMN的炎症反应，这与Baumgartner等[5]的实验结果相类似。临床救治时，同时大量输注的血液保存时间并不相同，这可能是造成救助效果不明显的原因之一，这种临床效应很多时候被临床医生忽视，或归因于疾病的并发症。提示在未来的实验中还应进行相关的基础支持研究，努力明确输血相关的副作用，提高临床输血安全。

[1]Silliman CC，Boshkov LK，Mehdizadehkashi Z，et al.Transfusion-related acute lung injury：epidemiology and a prospective analysis of etiologic factor[J].Blood，2003，101（2）：454-462.

[2]Motzkus D，Schulz MS，Heitland A.The novel beta defensin DEFB 123 prevents lipopolysaccharide mediated effects in vitro and vivo[J].FASEB J，2006，20（10）：1701.

[3]Sarah F，Andrew E，Leitch，et al.Neutrophil Apoptosis：Relevance to the Innate Immune Response and Inflammatory Disease [J].Innate Immun，2010，2（1）：216-227.

[4]Mesri M，Altieri DC.Endothelial cell activation by leukocyte microparticles[J].Immunol，1998，161（2）：4328-4337.

[5]Bumgartner JM，Nydam TL，Clarke JH，et al.Red Blood Cell Supernatant Potentiates LPS-Induced Proinflammatory Cytokine Response From Peripheral Blood Mononuclear Cells [J].Journal of Interferon&Cytokine Research，2009，29（6）：333-338.

[6]Vlaar APJ，Hofstra JJ，Levi M，et al.Supernatant of aged erythrocytes causes lung inflammation and coagulopathy in a “Two-Hit” in vivo syngeneic transfusion model[J].Anesthesiology，2010，113（1）：92-103.

[7]Mintz PD.Febrile reactions to platelet transfusion [J].Patho，1991，95（4）：609.

[8]Gonzalez R，Glaser J，Liu MT，et al.Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury[J].Exp Neurol，2003，184（1）：456-463.

[9]Jean-Baptiste E.Cellular mechanisms in sepsis [J].J Intensive Care Med，2007，22（3）：63-72.