川芎嗪对肝纤维化大鼠肝细胞线粒体脂质过氧化的保护作用

李学农福建医科大学省立临床学院/福建省立医院药学部，福建 福州 350001

脂质过氧化损伤是肝纤维化形成的重要病理因素，可以通过影响胶原代谢导致肝纤维化的形成。线粒体是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，在氧化磷酸化的过程中可产生一定量的自由基，当体内抗氧化体系受到破坏时，线粒体就会因脂质过氧化作用而受到损伤［1]。因此，保护线粒体功能的稳定是抗肝纤维化治疗的一个潜在的靶点。川芎嗪是从中药川芎中分离提取的有效成分。大量研究证明，川芎嗪具有抗脂质过氧化、抗炎、清除自由基以及改善血液流变学等多方面的药理作用，其体内外实验均证实川芎嗪具有确切的预防和治疗肝纤维化的作用［2-5]。本研究建立在前期研究的基础上，通过观察川芎嗪对肝细胞线粒体的保护作用，进一步完善川芎嗪抗肝纤维化的机制。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD大鼠40只，雄性，体重200±20g，由上海斯莱克公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005)，标准饲料，高压灭菌垫料和饮水，适应性饲养1星期。

1.2 药物与试剂

四氯化碳为国产分析纯、橄榄油 (山东鲁花集团有限公司);盐酸川芎嗪 (山东潍坊制药厂有限公司);DPH(sigma);碱性磷酸酶 (ALP)、谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)半自动生化仪专用试剂盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、Na-K-ATP酶及、Ca2+-ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 大鼠肝纤维化模型的建立

将40只大鼠适应性饲养1周后，随机分成5组，即正常组、模型组、川芎嗪低、中、高剂量组，每组8只。将CCl4配成50%橄榄油剂，模型组及给药组大鼠按1 ml/kg体重每周腹腔注射3次，同时正常组腹腔注射同体积的生理盐水，持续8周。自造模之日起，第3周开始用药组每周6次以川芎嗪低 (20mg/kg)、中 (40mg/kg)、高(60mg/kg)灌胃给药，正常及模型组灌胃同体积的蒸馏水。

2.2 肝功能指标ALT、AST、ALP的测定

末次给药后，将各组大鼠麻醉后颈总动脉取血，离心后分离血清，生化仪检测大鼠谷草转氨酶 (ALP)、谷丙转氨酶 (ALT)、碱性磷酸酶 (AST)的含量。

2.3 肝细胞线粒体的制备［6]

处死动物，迅速剖取肝脏，取一小块肝组织，称重后立即加入一定量的预冷生理盐水，冰浴匀浆，10 s/次，间歇30 S，连续2～3次，然后定容，制成10%肝匀浆，3 000×g 4℃冷冻离心10 min，弃沉淀取上清液以12000×g 4℃冷冻离心15 min，沉淀物即为线粒体，于-20℃冷冻过夜，融化后进行以下操作。

2.4 肝细胞线粒体内 MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶测定

收集的肝线粒体采用超声波法裂解，裂解后线粒体均用Bradford法测定蛋白含量。丙二醛 (MDA)采用硫代巴比妥酸 (TBA)法，超氧化物歧化酶 (SOD)采用羟胺法，Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶采用比色法，均按照试剂盒说明书进行操作。

2.5 肝细胞线粒体膜的流动性测定

采用荧光标记与荧光偏振法［7]。取线粒体3 ml，加入等体积DPH荧光探针液，混匀放25℃温育30 min，再离心经PBS洗涤1次，注入测试管。应用荧光分光光度计，在激发波长360nm，发射波长430nm测定膜荧光强度。膜脂流动性用荧光偏振度P、微粘度η表示，测量并记录样本的4个荧光强度。即 IVV、IVH、IHV、IHH，以 G(IHV/IHH)为校正因子。先按公式P=(IVV-GIVH)/(IVV+GIVH)计算出荧光偏振度P，再按公式η=2P/(0.46-P)计算出微粘度η。平均微粘度η越高，说明线粒体膜流动性越低，线粒体损伤越严重。

2.6 统计学分析

使用SPSS12.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差 (±SD)表示，组间采用t检验，P＜0.05具有统计学意义。

3 结果

3.1 肝纤维化大鼠造模结果

32只大鼠经造模后给药后，存活率为87.5%。其中，第2周死亡1例，第3周死亡1例，第6周死亡2例。死亡大鼠尸检可见腹腔内弥漫性化脓性炎症，肝脏颜色晦暗，肝组织上附着大量白斑及胶原状物质，组织学观察见肝组织广泛大面积坏死并伴有中性粒细胞浸润。

3.2 川芎嗪对大鼠肝功能指标ALT、AST、ALP的影响

结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP水平显著升高，具有极显著差异 (P＜0.01)。而川芎嗪治疗后，大鼠各项血清指标均降低，且在川芎嗪高剂量组时，与模型组相比，各项指标均具有显著性差异(P ＜0.05)。见表1。

表1 川芎嗪对大鼠肝功能指标ALT、AST、ALP的影响 (SD)

表1 川芎嗪对大鼠肝功能指标ALT、AST、ALP的影响 (SD)

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，* P＜0.05，＊＊ P ＜0.01

组别 N ALT(u/L) AST(u/L) ALP(u/L)8 30.25 ±3.08 99.70 ±13.41 218.36 ±14.07模型组 6 54.57 ±14.09##139.45 ±26.69## 294.77 ±45.88##川芎嗪低剂量组 7 47.81 ±16.77 134.43 ±9.07 285.22 ±35.67川芎嗪中剂量组 7 41.25 ±6.77* 117.31 ±8.84 251.67 ±17.19*川芎嗪高剂量组 8 37.41 ±7.85* 104.41 ±18.87* 229.68 ±38.61正常组*

3.3 川芎嗪对肝细胞线粒体内MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影响

结果显示，与正常对照组相比，模型组的SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的含量显著降低，MDA的含量显著升高，具有极显著性的差异 (P＜0.01)。而川芎嗪治疗组能够显著的升高SOD、Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶的含量，并且有效降低MDA的含量，与模型组相比，具有统计学意义。见表2。

表2 川芎嗪对肝线粒体内MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影响 (±SD)

表2 川芎嗪对肝线粒体内MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影响 (±SD)

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，* P＜0.05，＊＊ P ＜0.01

2.63 ±0.14 105.51 ±9.44 6.84 ±1.09 5.96 ±0.44模型组 2.92 ±0.05##82.94 ±9.20## 4.97 ±0.26## 4.71 ±0.42##川芎嗪低剂量组 2.78 ±0.14 88.99 ±6.99 5.24 ±0.43 5.03 ±0.15川芎嗪中剂量组 2.71 ±0.15* 94.91 ±6.80* 5.63 ±1.08 5.51 ±0.53*川芎嗪高剂量组2.62 ±0.09＊＊99.38 ±7.99* 5.76 ±0.53* 6.48 ±0.39-ATP正常组组别 MDA SOD Na-K+-ATP Ca2+＊＊

3.4 川芎嗪对肝细胞线粒体膜流动性的影响

图1 川芎嗪对肝线粒体膜流动性的影响

结果显示，与正常对照比相比，模型组的线粒题膜微黏度显著升高 (P＜0.01)，而经过川芎嗪治疗的大鼠的线粒体膜微黏度明显降低，具有剂量依赖性。与模型组比较，川芎嗪高剂量组具有显著性差异 (P＜0.05)，说明川芎嗪可以显著提高肝纤维化大鼠线粒体膜的流动性。见图1。

4 讨论

肝纤维化 (Hepatic Fibrosis)是肝细胞损伤后的修复机制，是多种慢性肝病发展到肝硬化的必由之路。研究表明，肝损伤导致体内自由基增多，引起肝脏脂质过氧化参与肝纤维化的发生发展过程。CCl4为亲肝性毒物，能够导致体内自由基增加，引起脂质过氧化，故本研究采用CCl4制作动物肝纤维化模型。其结果显示 CCl4模型血清中ALT、AST、ALP的含量明显高于正常组，而川芎嗪可以有效的减少以上各项指标。为了探讨其抗肝纤维化的具体的机制，我们分离了肝细胞线粒体进行以下研究。

脂质过氧化反应在体内胶原基因表达的调节中起主导作用，它是连结组织损伤与纤维化两个过程的纽带［8]。线粒体是细胞能量的主要来源，与氧自由基的产生、细胞死亡进程的调控有关。许多毒物可以通过脂质过氧化作用对线粒体膜、膜蛋白及线粒体DNA造成损伤。SOD是细胞内天然的氧自由基清除剂，而MDA则是氧自由基与细胞膜表面不饱和脂肪酸反应的产物，因此MDA与SOD构成了一对反应组织脂质过氧化和抗脂质过氧化的特征指标。本研究结果显示，肝纤维化大鼠线粒体中的MDA含量明显升高，SOD的活性显著降低，而川芎嗪给药组可以有效的逆转以上各项指标。Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶是生物体内广泛存在的一种极为重要的膜酶，二者对维持线粒体膜的正常功能具有十分重要的作用。本实验结果显示，肝纤维化大鼠的肝细胞线粒体中Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶的活性明显降低，在脂质过氧化反应增强，抗自由基损伤的作用减弱，其线粒体膜的微黏度升高，线粒体损伤严重。而川芎嗪可以可减轻肝纤维化过程中脂质过氧化和自由基损伤，恢复Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性，增加线粒体膜的流动性，保护线粒体的脂质过氧化作用，从而逆转肝纤维化的进程。

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