脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

王博蔚，高 尚，朱振威，刘春丽,朱 镇，刘志辉

(1.吉林大学第二医院妇产科，吉林 长春 130041；2.吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021；

3.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春 130021；4.江苏省镇江市口腔医院口腔修复科，江苏 镇江 212002)

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是能诱导血管生成、增加血管通透性及维持血管功能的强效促血管形成因子，在创伤愈合过程中发挥重要作用[1-3]，将其运用于难愈性创伤的治疗是目前研究的焦点，VEGF家族有5种亚型，其中VEGF165是最为重要的表型。因为VEGF半衰期较短，在正常组织中约为30～45 min，在缺血部位能延长至6～8 h，这就要求有一个缓释系统以延长VEGF作用于创伤修复部位的时间。近年研究者[4-10]发现：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪源间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在创伤修复领域具有重要应用潜能，可以向创伤局部扩充归巢，向创伤修复细胞—内皮细胞及成纤维细胞定向分化或通过创造增强修复的微环境促进组织内源性细胞的再生，从而加速创伤愈合；干细胞同时也是基因治疗的良好载体细胞，可以携带目的基因到达靶区域发挥治疗作用。人胎盘源间充质干细胞(human placenta -derived mesenchymal stem cells，HPMSCs)是近几年逐渐受到关注的新的成体干细胞来源，本文作者前期研究[11-12]表明：HPMSCs在形态及生物学性状方面与BMSCs基本一致，在特定诱导条件下可以向内皮细胞定向分化，提示HPMSCs可以作为创伤修复的种子细胞。本研究拟构建VEGF的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165，并通过脂质体法将其转入HPMSCs中，探讨hVEGF165对HPMSCs增殖的影响及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能，旨在为进一步应用VEGF转基因干细胞移植方法治疗难愈性创伤的研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人白血病细胞 HL-60(吉林大学第二医院沈维章博士惠赠)，大肠杆菌 DH5α(吉林大学白求恩医学院生物化学与分子生物学实验室)。HPMSCs已经本实验室培养并鉴定,来源于吉林大学第二医院产科废弃的胎盘，经产妇同意，通过密度梯度离心法分离培养获得。HPMSCs属于成体干细胞，不涉及伦理问题，引物(Cyagen Biosciences),RT-PCR试剂盒、 琼脂糖,T4噬菌体DNA连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒(Promega)，限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ(Takara)，LB(明海生物制品公司),DNA-Marker、Trizol、 溴化乙锭(EB) 、DEPC和IMDM 培养液(Sigma,USA)，小牛血清(Hyclone)，PBS(北京中山生物技术有限公司)，pMD18 T vector和真核表达质粒 pIRES2-EGFP (Clontech,USA)，Lipofectin脂质体悬液(Gibco)，DEME培养基、ECV304(基础医学院生化教研室惠赠)，G418选择培养基(宝泰克公司)。

1.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165的构建及鉴定

1.2.1 目的基因片段VEGF165的获得与扩增 HL-60 细胞用含10%小牛血清的 IMDM 完全培养液培养，待细胞生长达瓶底 80%时，收集细胞、计数，用 Trizol 提取 HL-60 细胞的总 RNA，测定RNA的浓度，A260/A280比值在 1.8 时最佳。cDNA 第1 链采用Oligo ( dT) 和M-MLV 反转录酶，按操作说明合成。PCR 引物设计与合成：从 GenBank 中查找 hVEGF165 的全长基因序列，按照引物设计的基本原则，设计1对上游由启始密码子ATG 开始，下游以终止密码子TGA 结尾的引物，并分别在上、下游引物上添加EcoRⅠ与BamHⅠ 限制性酶切位点序列，送Cyagen Biosciences合成hVEGF165引物序列：上游，5′-CGGAATTCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-TG-3′，含EcoRⅠ 限制性酶切位点；下游,5′-CGGGATCCTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3′，含BamHⅠ 限制性酶切位点。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收和纯化。将纯化后的hVEGF165 PCR产物连接至克隆载体 pMD18 -T vector。连接产物转化到感受态细胞DH5α中。观察菌落生长情况，蓝、白斑筛选阳性细菌克隆，培养后进行 PCR 筛选,最后进行重组克隆载体 pMD18-T vector-hVEGF165 的酶切鉴定。

1.2.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165 的构建及鉴定 用EcoRⅠ 、BamHⅠ 双酶切 pMD18-T-hVEGF165与pIRES2-EGFP，用T4DNA连接酶将上述回收产物进行粘端连接，构建 pIRES2-EGFP-hVEGF165，连接产物转化感受态细胞 DH5α,pIRES2-EGFP-hVEGF165 的双酶切鉴定。

1.3 pIRES2-EGFP-hVEGF165转染HPMSCs

1 mL无血清完全DEME稀释pIRES2-EGFP-hVEGF165和pIRES2-EGFP，涡旋1 s,加Lipofectin脂质体悬液，再涡旋，室温放置5～10 min，使二者结合，制备pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin复合物和pIRES2-EGFP-Lipofectin复合物。A组在每个培养孔的培养细胞中加入pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin复合物;B组在每个培养孔的培养细胞中加入pIRES2-EGFP -Lipofectin复合物;C组为对照组(未转染组，有pIRES2-EGFP-Lipofectin 无 HPMSCs)。将细胞培养于最小致死剂量0.5 g·L-1的G418选择培养基中，抗性细胞筛选，15 d筛选出阳性细胞克隆，其阳性克隆在0.5 g·L-1的G418维持剂量下继续扩大培养2周备用。

1.4 HPMSCs转染pIRES2-EGFP- hVEGF165后VEGF表达活性鉴定

①转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表达VEGF蛋白的Western blotting检测;②MTT法检测转染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs所表达的VEGF的生物学活性:将人内皮细胞株ECV304用2×103孔密度接种于96孔培养板中，并加入1/2体积的各组转染上清液,加入MTT溶液继续培养4 h，再加入DMSO液100 μL,震动摇晃，待蓝色沉淀充分溶解后，测定各孔A480值。③MTT法检测转染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs增殖活性的变化：分别取生长良好的传代细胞接种于96孔板，每孔加各组细胞悬液200 μL，培养36 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO。选择490 nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔的A值。④荧光显微镜下观察重组质粒的转染结果：通过报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)观察目的基因转染情况。

1.5 鉴定转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs的多向分化潜能

①成脂肪诱导。诱导体系：含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松1 μmol·L-1、消炎痛200 μmol·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1、胰岛素10 mg·L-1，油红染色鉴定脂滴形成。②成软骨诱导。诱导体系：含2.5%经筛选FBS的DMEM-HG并加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠6.25 mg·L-1、BSA 1.25 mg·L-1、丙酮酸钠1 mmol·L-1，抗坏血酸磷酸37.5 mg·L-1，TGF-β150 μg·L-1，Alcian blue染色鉴定。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 pIRES2-EGFP-hVEGF165的构建及鉴定

2.1.1目的基因片段的扩增 VEGF165 基因序列全长为 576 bp,取逆转录 PCR 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，在大约 600 bp 处出现有目的条带，见图1。

2.1.2 重组克隆载体 pMD18-T-hVEGF165 的双酶切鉴定 限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组克隆载体电泳结果显示：在约600 bp 处出现一条带，与目的片段大小一致。见图2。

2.1.3 重组表达载体的酶切鉴定 pIRES2-EGFP-hVEGF165重组表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳结果显示：重组体中含有与目的片段大小一致的片段。见图3。

图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图2 pMD18-T-hVEGF165重组质粒EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后电泳图

图3 EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pIRES2-EGFP-hVEGF165的电泳结果

2.2 pIRES2-EGFP- hVEGF165转染HPMSCs

2.2.1 G418筛选结果 C组在第5天时细胞已经全部死亡；而A组与B组在筛选的第7天有少数细胞存活，每低倍视野约为1～5个细胞，转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs经G418选择性培养基筛选，15 d后出现阳性细胞克隆。见图4。

图4 转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs

2.2.2 RT-PCR检测hVEGF165的表达 在凝胶图像分析系统上可见A组HPMSCs 中hVEGF165的表达较B组强。B组也有与目的片段大小一致的片段表达。见图5。

2.2.3 转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表达hVEGF165的Westren blotting分析 B组在45 000 bp 处见一表达较弱反应显色带，而A组在45 000 bp处显现单一特异性较强反应显色带，为hVEGF165基因表达产物。见图6。

图6 Western blotting检测转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs 中hVEGF165的表达

2.2.4 MTT法检测转染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs中VEGF165的生物学活性 A组HPMSCs表达的VEGF165的生物学活性(0.870 0±0.028 5)明显高于B组(0.690 0±0.087 6)和C组(0.540 0±0.012 4) (P<0.01)，B组高于C组(P<0.05)，组间比较差异均有统计学意义。

2.2.5 转染hVEGF165的HPMSCs细胞增殖活性的变化 A组HPMSCs增殖活性(0.624±0.019)明显高于B组(0.426±0.016)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 荧光显微镜下重组质粒转染结果

转染48 h后，A和B组中均可见大量表达EGFP的细胞;转染48～72 h后，为绿色荧光表达高峰期;1周后表达开始减弱，至3周时仍可见EGFP的表达。见图7(插页三)。

2.4 转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs多向分化潜能的鉴定

在成脂肪诱导环境下诱导2周后，用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色(图8A，见插页三)；在成软骨诱导环境下诱导2周后，将细胞团打散涂片，Alcian blue染色，高倍镜下可见Ⅱ型胶原形成的细胞外基质被特异性染成蓝色(图8B，见插页三)。

3 讨 论

目前基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，几乎渗透到医学研究的各个领域。VEGF在促进创伤修复与组织愈合过程中发挥的重要作用已经得到学者的普遍认同，但是由于VEGF单独应用存在半衰期短、穿透力差、易于吸附细胞外基质、生物利用率低、需反复使用且剂量较大、费用昂贵等不利因素，使其临床应用受到限制。随着分子生物学的发展，通过转基因技术使创面局部组织VEGF165高效、长效表达，可克服直接应用外源性VEGF165的缺点，并利用干细胞作为目的基因的载体，一方面发挥其本身促进创伤的作用，另一方面运送目的基因到达靶区域发挥促愈作用，有望为难愈性创伤的治疗开辟新的途径。本实验成功构建pIRES2-EGFP-hVEGF165。脂质体介导基因转染法是目前最常用的方法之一,技术成熟,安全可靠；其中以阳离子脂质体介导的载体系统(质粒) 的应用最为广泛,其无免疫原性、无毒、无致癌性,易大量制备,转染效率虽不及病毒载体高,但已通过美国国立卫生研究院(NIH) 和重组DNA 咨询委员会(RAC) 的批准作为基因治疗的载体进入Ⅱ期临床试验,用于某些癌症的治疗。因此,从后期动物实验安全等方面的综合考虑,本实验选择阳离子脂质体介导的pIRES2- EGFP-hVEGF165转染HPMSCs,使VEGF在细胞内高效、稳定地暂时表达。这既符合创伤修复基因治疗的要求,同时又避免病毒载体介导的基因治疗有可能存在的潜在缺陷性。转染48 h后，通过荧光显微镜可以观察到A组及B组中有大量EGFP表达，提示报告基因已成功转入HPMSCs，说明脂质体介导的pIRES2-EGFP-hVEGF165转染HPMSCs是可行的。RT-PCR及Western blotting检测均发现pIRES2-EGFP-hVEGF165转染的HPMSCs有VEGF强表达，pIRES2-EGFP转染的HPMSCs也有VEGF的表达，但表达较弱；本实验结果一方面说明VEGF已成功转入HPMSCs中，另一方面说明HPMSCs本身具有VEGF的内分泌功能。

本研究中MTT法结果表明：转染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs所表达的hVEGF165的生物学活性明显提高，提示hVEGF165转染HPMSCs后得到持续高效表达。转染pIRES2-EGFP的HPMSCs所表达的hVEGF165的生物学活性高于空白对照组，提示HPMSCs本身具有hVEGF165的内分泌功能。转染pIRES2-EGFP-hVEGF165后HPMSCs的增殖活性明显增强，说明hVEGF165对HPMSCs的增殖起促进作用。

综上所述，本实验成功构建了pIRES2-EGFP- hVEGF165真核表达载体，并运用脂质体转染法将其成功转入HPMSCs中，一方面hVEGF165在HPMSCs中有较强表达并被正确修饰，说明HPMSCs可以作为hVEGF165基因治疗的载体细胞,转VEGF基因HPMSCs可以实现hVEGF165的缓释长效作用；另一方面提示HPMSCs本身也具有内分泌hVEGF165的功能，但作用较弱，hVEGF165对HPMSCs的增殖具有明显促进作用。本实验为下一步运用携带hVEGF165基因的HPMSCs治疗难愈性创伤的研究奠定了实验基础。

[参考文献]

[1]Parati EA,Bez A,Ponti D,et al.Biological features and therautic potential in Parkinson’s disease [J].Neurosurg Sci，2003,47(1):8-17.

[2]Jackson KA,Majka SM,Wang H,et al.Regerneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells [J].Clin Invest，2001，107(11):1395-1402.

[3]Suzuki T,Nishida M,Futami S,et al.Neoendothelialization after perpheral blood stem cell transplantation in humans:a case report of a Tokaimura nuclear accident victim [J].Cardiovasc Res，2003，58(2):487-492.

[4]Kajstura J,Rota M,Wang B,et al.Bone marrow cells differentiate in cardiac cell lineages sfter infarction independently of cell fusion [J].Circ Res,2005,96(1): 127-137.

[5]Brittan M,Braun KM,Reynolds LE,et al.Bone marrow cells engraft within the epidermis and proliferate in vivo with no evidence of cell fusion [J].J Pathol,2005,205(1): 1-13.

[6]Fathke C,Wilson L,Hutter J,et al.Contribution of bone marrow derived cells to skin:collagen deposition and wound repair[J].Stem Cells,2004,22(5):812-822.

[7]Badiavas EV,Abedi M,Butmarc J,et al.Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing [J].Cell Physiol,2003,196(2): 245-250.

[8]Hofstettr CP,Schwarz EJ,Hess D,et al.Marrow stormal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery [J].Proc Natl Acad Sci,2002,99(4): 2199-2122.

[9]雷永红，付小兵，盛志勇,等.大鼠脂肪干细胞(rADSCS)转运VEGF基因促进随意皮瓣成活的研究 [J].中国美容医学,2007,16(1)：7-11.

[10]Short B,Brouard N,Occhiodoro T,et al.Mesenchymal stem cells [J].Arch Med Res,2003,34(6): 565-571.

[11]刘春丽，刘志辉，王博蔚,等.人胎盘源间充质干细胞多向分化潜能的实验研究[J].中国实验诊断学,2009,13(8)：1022-1024.

[12]刘志辉，周延民，王博蔚，等.体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化[J].吉林大学学报：医学版,2010,13(8)：1022-1024.